基于液質聯用技術的鎮江香醋中十種黃酮類物質含量的同時測定

魏 巍，周琪樂，紀鳳娣，陶匯源，魯 緋，夏 蓉*

（1.北京市營養源研究所，北京 100069；2.鎮江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮江 212000）

鎮江香醋（普通醋和陳年醋）作為我國的四大名醋之一，是中國傳統發酵食醋的典型代表，其特有的“固態分層發酵”多菌種混合釀造工藝是世界非物質文化遺產，賦予鎮江香醋別具一格的風味和獨特的口感。它具有“酸而不澀，香而微甜，色濃而味鮮，愈存愈香”的特點[1-2]。千百年來，食醋不但是調味不可缺少的佳品，還是一種醫藥良藥。研究表明釀造食醋含有豐富的營養成分，具有獨特的藥理作用[3-4]。釀造食醋中含有有機酸、氨基酸、酚類、黃酮類和吡嗪類等活性物質，具有抗疲勞、調節血糖、調節血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、促進食欲、預防骨質疏松等多種生理功能，其中黃酮類和酚類、多酚類等類黃酮物質具有重要生物活性及保健功能，能起到抗炎、抗氧化、抗癌等作用[5-7]。因此，研究建立一種簡便、快速、準確、靈敏的同時測定食醋中多種黃酮類物質的分析方法顯得尤為重要。

近年來，對橙皮素[8-9]、牡荊素[10]、表兒茶素、柚皮素、山柰酚[11-12]、槲皮素[13-14]、金絲桃苷[15-16]、木犀草素[17]、柚皮苷[18-19]和橙皮苷[20-21]等黃酮類化合物生物功能的研究報道較多，這些物質均為黃酮類或類黃酮類化合物，具有類似的分子結構和天然的生理活性。目前采用液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對這十種黃酮類化合物中某個成分或是多個成分在植物[8，14，21，25，27，29]、中成藥[26，30，32]、食品[22，31]和生化樣品[23-24，28]中的含量分析的報道比較多見，而對于發酵食品，特別是釀造食醋進行多指標黃酮類化合物的定量分析卻少見報道。迄今為止，對鎮江香醋中有機酸、氨基酸和風味物質的研究較多[4-7]，對黃酮類和類黃酮類化合物的研究報道仍以生物活性的研究為主。本研究對鎮江普通醋和陳年醋中上述十種黃酮類化合物的含量進行了分析，建立了一種測定釀造食醋中十種黃酮類物質含量的超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performanceliquid chromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS）法。可以作為食醋中黃酮類物質定量檢測的理論依據，為食醋中這類化合物的綜合利用提供參考。

圖1 十種黃酮類化合物的分子結構Fig.1 Molecular structure of ten kinds of flavonoids compounds

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮江普通醋、陳年醋：江蘇恒順集團有限公司。

柚皮素（純度≥99%）、木犀草素（純度≥99%）、山奈酚（純度≥98.5%）、表兒茶素（純度≥98%）、橙皮素（純度≥98.5%）、牡荊素（純度≥98%）、金絲桃苷（純度≥99%）、柚皮苷（純度≥98.5%）和橙皮苷（純度≥98%）：成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純）：Fisher scientific；甲酸（分析純）：北京化工廠；其他試劑均為國產分析純；超純水采用Mili-Q制備。

1.2 儀器與設備

ACQUITY Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（UPLC-MS/MS）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）：美國Waters公司；2200TH超聲波清洗機：上海安譜實驗科技股份有限公司；EYELA OSB-2100旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；Centrifuge 5430高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

柚皮素、木犀草素、山奈酚、表兒茶素、橙皮素、牡荊素、金絲桃苷、柚皮苷、橙皮苷和槲皮素十種黃酮類化合物用體積分數為90%的甲醇水溶液配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，使用時逐級稀釋為25 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的標準混合溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準確移取食醋樣品2.0mL于10mL離心管中，加入體積分數為70%甲醇水溶液（V/V）8.0 mL，超聲處理30 min（功率100 W），混勻后以6 000 r/min離心5 min，吸取上層清液過0.22 μm膜后備用。

1.3.3 超高效液相色譜和質譜條件

超高效液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱溫35℃，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速0.4 mL/min，流動相梯度：0→1.0 min，B相5.0%；1.0→3.0 min，B相5.0%→90.0%；3.0→3.5 min，B相90.0%→5.0%；3.5→5.5 min，B相5.0%→5.0%。

質譜條件：離子化模式為電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），負離子模式掃描，多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度200℃，去溶劑輔助加熱溫度350℃；去溶劑氣以及霧化器均采用高純氮氣（N2），去溶劑氣和錐孔反吹氣流速分別為500 L/h和50 L/h，碰撞氣為高純氦氣（He），流速為0.4 mL/min；目標物電離毛細管電壓2 000 kV；引導目標母離子進入錐孔的錐孔電壓45 V；影響母離子裂解程度的碰撞能量優化后的具體參數見表1。

表1 十種黃酮類化合物的質譜分析參數Table 1 MS analysis parameters of ten kinds of flavonoids compounds

2 結果與分析

2.1 標準曲線線性關系和范圍

對鎮江普通醋和陳年醋中十種黃酮類物質含量分析的超高效液相色譜-串聯質譜色譜圖見圖1。

將質量濃度分別為25 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的各混合標準溶液在優化后的超高效液相色譜-串聯質譜條件下進樣分析，得到以標準溶液的質量濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標的標準曲線，其回歸方程和相關系數見表2。

由表2可知，十種待測成分在質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數R均≥0.99。以3倍的信噪比確定各化合物的檢出限，結果表明柚皮素、木犀草素、山奈酚、表兒茶素、槲皮素、橙皮素、牡荊素、金絲桃苷、柚皮苷和橙皮苷的檢出限分別為4.0 ng/mL、2.0ng/mL、1.0ng/mL、4.0ng/mL、1.0ng/mL、4.0ng/mL、1.0ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL和1.0 ng/mL。

圖2 鎮江普通醋和陳年醋中十種黃酮類物質含量超高效液相色譜-串聯質譜色譜分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of ten kinds of flavonoids compounds in Zhenjiang ordinary vinegar and aged vinegar analysis by UPLC-MS/MS

表2 十種黃酮類化合物的回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,linear range and detection limits of ten kinds of flavonoids compounds

2.2 精密度試驗

取500 ng/mL的混合標準溶液在1.3.3的超高效液相色譜-串聯質譜條件下連續進樣6針，結果見表3。由表3可知，各組分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為柚皮素1.1%，木犀草素1.3%，山奈酚1.5%，表兒茶素2.6%，槲皮素2.2%，橙皮素1.8%，牡荊素1.9%，金絲桃苷1.6%，柚皮苷1.1%，橙皮苷1.4%，RSD均＜5%，結果表明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

2.3 加標回收率試驗

準確移取2.0 mL鎮江普通醋樣品共18份，樣品1～6號、樣品7～12號和樣品13～18號分別加入質量濃度為10.0μg/mL的混合標準溶液200μL、50μL、10μL，按照1.3.2和1.3.3試驗條件進行樣品處理和分析測定，得到各組分的加標回收率見表4。由表4可知，十種化合物的平均加標回收率為93.9%～99.0%，測得各成分加標回收試驗結果的平均RSD分別為柚皮素2.3%，木犀草素1.7%，山奈酚2.6%，表兒茶素1.9%，槲皮素3.5%，橙皮素2.9%，牡荊素1.7%，金絲桃苷2.2%，柚皮苷3.8%，橙皮苷2.4%，RSD均＜5%，結果表明該方法準確性良好。

表4 加標回收率試驗結果Table 4 Results of standard recovery rate tests

續表

2.4 樣品中黃酮類物質含量測定

準確移取鎮江普通醋和陳年醋樣品2.0 mL，按照1.3.2和1.3.3試驗條件進行樣品處理和測定，測得各組分的含量見表5。由表5可知，鎮江普通醋和陳年醋中分別檢出4種、5種黃酮類化合物，共有黃酮化合物為金絲桃苷、柚皮苷及橙皮苷，兩種醋中黃酮類化合物的組成不同，木犀草素僅在鎮江普通醋中檢出，而山奈酚和牡荊素僅在陳年醋中檢出。在兩種香醋中金絲桃苷的含量分別高達0.948μg/100mL和0.772 μg/100 mL，黃酮類化合物的總含量相似，分別為1.712 μg/100 mL和1.716 μg/100 mL。

表5 鎮江普通醋和陳年醋種各黃酮類化合物的含量Table 5 Contents of each flavonoids compounds in Zhenjiang ordinary vinegar and aged vinegar

3 結論

本實驗建立了一種簡便、快速、靈敏、準確的UPLC-MS/MS方法，可同時檢測鎮江香醋中柚皮素、柚皮苷、橙皮素、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、金絲桃苷、牡荊素、槲皮素和表兒茶素共十種黃酮類化合物的含量。研究結果發現，黃酮類成分在普通C18色譜柱上就能很好的實現分離，多反應監測（MRM）模式可有針對性的選擇數據采集質譜信號，通過兩級離子選擇排除干擾離子，能實現10種黃酮類成分的同時測定。在探索離子掃描模式時發現，在負離子模式下黃酮類成分響應較好。對甲醇和乙腈作為流動相時的色譜分離情況的考察發現，乙腈在實現分離的同時縮短了實驗時間，并且加入0.1%的甲酸能很好的修飾峰形。研究結果證明以0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相，采用梯度洗脫的方法，流速為0.4 mL/min時，不僅保留時間適當，而且分離度良好。方法學考察表明該方法的準確性和重復性符合國家標準GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》中的規定。本實驗所建立的方法準確、靈敏，色譜、質譜條件經過優化能在5.5 min內實現釀造食醋中十種黃酮類成分的含量測定。