γ射線輻照預處理玉米秸稈發酵產乙醇的研究

張 勇,郭棟豪,王克勤,武小芬,齊 慧,鄧 明,陳 亮*

(1.湖南省農業科學院 湖南省核農學與航天育種研究所,湖南 長沙 410125;2.湖南省農業生物輻照工程技術研究中心,湖南 長沙 410125;3.湖南大學 隆平分院,湖南 長沙 410125)

我國是農業大國,農業生產每年都產生數量豐富的秸稈生物質。據統計,2016年全國農作物秸稈產量為8.16億t,其中玉米秸稈的產量最大,占總量的36.88%[1]。目前秸稈綜合利用水平和效率還比較低,主要集中在肥料化、燃料化、飼料化方面。隨著經濟與社會的發展,秸稈的傳統利用方式在逐漸萎縮,秸稈資源處于嚴重相對過剩狀態,秸稈露天焚燒事件屢見不鮮,給生態環境帶來巨大壓力,因此為秸稈利用尋求新的途徑迫在眉睫。

與此同時,在傳統化石能源日益枯竭的背景下,將數量巨大的秸稈類木質纖維素轉化為生物質能源越來越引起人們的興趣[2]。很多國家從20世紀70年代左右就已經開始了以可再生資源作為補充替代能源的研究[3]。預處理是秸稈等木質纖維素煉制生物質能源的關鍵技術瓶頸之一。有效的預處理能破壞秸稈的物理化學結構,有助于提高秸稈的轉化效率,但同時增加預處理工序又會提高生產成本,還可能因為預處理過程使用的酸堿化合物而造成環境污染,因此能否達到多方面的平衡成為評價預處理方法是否可行的重要依據。γ射線輻照是一種很有特色木質纖維素的預處理手段,與常見的預處理方法比較,秸稈在輻照預處理時無需水的參與,也不需要添加酸堿等化合物,因此無環境污染的顧慮,并且輻照處理過程是在常溫下進行,因此能耗低,最關鍵的是經過輻照處理后,秸稈的糖化效率可以數倍的提高[4-5]。但是關于輻照預處理木質纖維素的研究大多集中在酶解糖化階段[6-7],對后續發酵產乙醇工藝研究較少。因此,以γ射線輻照為預處理手段,探討玉米秸稈酶解發酵產乙醇的一些基本問題,可以為玉米秸稈煉制燃料乙醇提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈:2016年10月采集于湖南省作物研究所試驗田。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):中國工業微生物菌種保藏管理中心(china center of industrial culture collection,CICC)31014。

香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸(均為色譜純):德國Sigma公司;甲酸、乙酸、糠醛、對羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、無水葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、乙腈、甲醇、無水乙醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、硼氫化鈉、硫酸、磷酸氫二銨、無水氯化鈣、氫氧化鈣、氫氧化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;酵母粉(生化試劑):廣東環凱微生物科技有限公司;纖維素酶(40FPU/mL):Novozymes公司。

發酵培養基:硫酸銨2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、無水硫酸鎂1 g/L、無水氯化鈣0.2 g/L、酵母粉5 g/L;pH≈6(碳源為玉米秸稈)。121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

60Co-γ輻照裝置:湖南省核農學與航天育種研究所;Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC):賽默飛世爾科技(中國)有限公司;TG16-Ⅱ臺式高速離心機:長沙平凡儀器儀表有限公司;YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌器:上海博迅實業有限公司醫療設備廠;HZQ-F100恒溫搖床:常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸稈輻照處理

玉米秸稈在60℃條件下烘干,切成5 cm左右的小段,裝入金屬樣品盒,于室溫條件下用60Co-γ射線進行輻照預處理,輻照劑量率為1.25 kGy/h。

1.3.2 玉米秸稈脫毒處理與發酵

脫毒處理:分別稱取吸收劑量約800 kGy、絕干質量為10 g的輻照玉米秸稈粉于250 mL的具塞錐形瓶中,分三組分別加入100 mL去離子水、100mL氫氧化鈣溶液(pH=11)、100 mL 20 mmol/L硼氫化鈉溶液,然后置于恒溫搖床中,37℃、150 r/min條件下處理2 h,結束后取出過濾。

乙醇發酵:取100 mL發酵專用具塞錐形瓶,分別加入1.5 g的上述3種脫毒處理所得樣品濾渣,滅菌后加入27 mL發酵培養基,再按20 FPU/g固體加入纖維素酶,最后加入3 mL種子培養液,置于恒溫搖床中,37℃、150 r/min條件下進行同步糖化發酵(simultaneous saccharification and fer mentation,SSF)。

1.3.3 玉米秸稈在不同工藝條件下的乙醇發酵

玉米秸稈的酶解:向錐形瓶中加入pH 5.0左右的發酵培養基45 mL和吸收劑量約800 kGy、絕干質量為5 g的輻照玉米秸稈粉,置于高壓滅菌鍋中,121℃滅菌20 min,冷卻后按20 FPU/g固體加入纖維素酶。

玉米秸稈的發酵:同步糖化發酵,在加入纖維素酶時同步加入釀酒酵母,發酵溫度為37℃;分步糖化發酵(sepa rate hydrolysis and fermentation,SHF)則是在50℃振蕩酶解48 h后再接入釀酒酵母,發酵溫度為37℃;變溫同步糖化發酵(nonisothennal simultaneous saccharitlcation and fermentation,NSSF)是在加入纖維素酶時同步加入釀酒酵母,于37℃條件下發酵,期間每發酵12h便將溫度升至42℃保持20 min,之后在37℃條件下繼續發酵,如此反復直至發酵結束;半同步糖化發酵(hemi simultaneous saccharification and fermentation,HSSF)是在50℃條件下酶解12 h后再接入釀酒酵母發酵,發酵溫度為37℃。所有發酵實驗的酵母接種量均為10%。

1.3.4 測定方法

木質纖維素含量:按照參考文獻[8]的方法進行測定;纖維素酶酶活:按照參考文獻[9]的方法進行測定;單糖、乙醇含量:按照參考文獻[10]的方法進行測定;抑制物含量:按照參考文獻[11]的方法進行測定。

乙醇轉化率按下式計算:

2 結果與分析

2.1 不同輻照處理強度對玉米秸稈化學及物理性質的影響

表1 輻照對玉米秸稈主要化學組分的影響Table1 Effect of irradiation on main chemical constituents of corn straw

從表1可以看出,玉米秸稈經過輻照后,3種主要化學組分的含量都不同程度的降低,說明γ射線對玉米秸稈的3種主要化學組分都有降解作用,且在實驗范圍內,3種組分含量與輻照強度呈負相關,說明輻照強度越大,這3種化學組分降解越嚴重,孫豐波[12]在用γ射線輻照竹材時也發現該現象,本課題組之前在研究γ射線輻照對水稻秸稈化學組分時還發現輻照在降低水稻秸稈木質纖維素含量的同時會使秸稈的可溶性糖大幅度提高[13],因此輻照后玉米秸稈纖維素、半纖維素含量的大幅度降低并不意味著糖的大量損失,而可能意味著大分子的纖維素、半纖維素被降解成較低分子量的糖;3種化學組分對輻照的敏感程度不一,木質素含量變化最小,說明對輻照最穩定,半纖維素含量變化最大,說明最容易被降解,這可能與其化學結構的穩定性有關,木質素是由苯環類化合物組成,結構穩定,因此難降解,而半纖維素屬于雜多糖,且側鏈較多,結構穩定性差,因此容易被降解[14]。

玉米秸稈經不同輻照劑量處理后表觀結構的變化情況見圖1。

圖1 輻照對玉米秸稈表觀結構的影響Fig.1 Effect of irradiation on apparent structure of corn straw

從圖1可以看出,未經輻照的玉米秸稈表觀結構相對平滑、完整,輻照后的玉米秸稈微觀結構變的粗糙多孔,說明輻照對玉米秸稈的微觀結構有明顯的破壞作用,在水稻、芒草、蘆葦秸稈中發現過類似現象[13,15-16]。這種疏松多孔結構增加了玉米秸稈的表面積,有利于秸稈生物煉制過程中酶與底物接觸,提高酶解轉化效率。

2.2 不同脫毒處理對輻照玉米秸稈乙醇發酵的影響

由于預處理是將木質纖維素原有物理化學結構破壞并重組的過程,因此不可避免的會生成新化合物,其中就包括抑制發酵的物質,并且預處理方式、原料種類對抑制物的生成都有影響[17]。經過輻照處理的玉米秸稈在水洗、氫氧化鈣和硼氫化鈉脫毒處理后,脫毒濾液中部分抑制物的濃度情況見表2,濾液中抑制物含量越高,則殘渣中抑制物含量越小,脫毒處理對抑制物脫除效果越好。

有機酸是木質纖維輻照處理過程中最常見的副產物,也是一類常見的發酵抑制物,由表2可知,氫氧化鈣處理對甲酸的脫除效果最佳,約為水處理的2.5倍;氫氧化鈣和硼氫化鈉對乙酸脫除效果相當,都明顯優于水處理,對于其他有機酸,除對香豆酸外,3種處理差別不是非常明顯;而對于另一種強發酵抑制物糠醛,氫氧化鈣和硼氫化鈉處理的脫除率約為水的2倍,但是3種處理液中糠醛的含量都不高,可能是木質纖維素輻照過程中糠醛生成量較少的原因。

表2 不同脫毒處理對脫除抑制物效果的影響Table2 Effect of different detoxification treatments on detoxification inhibitors effect

圖2 不同脫毒處理對輻照玉米秸稈乙醇轉化率的影響Fig.2 Effect of different detoxification treatments on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由圖2可知,三種脫毒方式處理后發酵72 h時乙醇轉化率均基本達到最大值。三種脫毒處理玉米秸稈乙醇轉化率大小順序為:硼氫化鈉處理(73.6%)＞氫氧化鈣處理(70.8%)＞水洗(66.7%),均顯著高于未脫毒處理玉米秸稈乙醇轉化率(56.0%)(P＜0.05)。因此,脫毒處理對提高輻照玉米秸稈乙醇轉化率有明顯作用。

2.3 不同發酵工藝對輻照玉米秸稈乙醇發酵影響

圖3 不同發酵工藝對輻照玉米秸稈乙醇轉化率的影響Fig.3 Effect of different fermentation processes on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由于不同預處理方法的作用原理及作用效果都不相同,加上不同原料的化學成分、物理性質也不相同,因此可能導致后續的酶解發酵工藝可能需要根據實際情況進行優化[18],選擇合適的酶解發酵工藝是工藝條件優化的第一步。由圖3可知,經過輻照的玉米秸稈都能發酵獲得乙醇,并且發酵24h后乙醇轉化率都接近或達到最大值,發酵完成時間和單糖發酵產乙醇時間相當,發酵效率比較高,主要原因是秸稈中大分子纖維素和半纖維素在輻照后已經被降解成小分子多糖,多糖水解為單糖的速率大大加快;SHF、NSSF、HSSF和SSF的乙醇轉化率分別為41.9%、41.9%、39.6%和55.9%,可以看出前3種工藝的乙醇轉化率差異不大,而SSF獲得的乙醇轉化率較另外3種工藝高,說明對于玉米秸稈而言,SSF與輻照預處理的適配性比較好。

3 結論

本實驗對射線輻照處理玉米秸稈進行了發酵產乙醇研究,發現γ射線輻照能破壞玉米秸稈物理化學結構,但同時發現在輻照后的玉米秸稈中存在甲酸、乙酸、糠醛、對羥基苯甲酸、四羥基苯甲醛、對香豆酸等發酵抑制物,脫毒處理能降低抑制物濃度并顯著提高乙醇轉化率(P＜0.05),其中硼氫化鈉脫毒后的玉米秸稈乙醇轉化率最高,為73.6%;初步研究了發酵工藝與輻照預處理的適配性,發現SSF與γ射線輻照預處理的玉米秸稈適配性最好,該工藝下輻照玉米秸稈乙醇轉化率為55.9%。