不同發酵方式下甘藍泡菜中有機酸的HPLC分析

王芮東,衛博慧,李 楠,楊金菊

(1.運城學院 理科實驗中心,山西 運城 044000;2.運城學院 生命科學系,山西 運城 044000)

泡菜是利用濃度較低的鹽水來腌漬新鮮蔬菜,并通過乳酸菌厭氧發酵制成的具有咸酸口味的浸漬品[1-4],其營養豐富,含有較高的碳水化合物、蛋白質、氨基酸和維生素等營養成分[5-6],并且具有抗突變活性、抗癌以及抗衰老等作用[7-9]。泡菜的發酵方式主要包括傳統發酵和純種發酵2種方式,家庭、小作坊等生產以傳統發酵方式為主,在蔬菜中按一定比例加入鹽水、自制泡菜菌水以及老泡菜水等進行自然發酵,如:自然發酵、自制泡菜菌發酵和老泡菜水發酵等;大規模的工業化生產主要應用純種發酵方式,在蔬菜中加入鹽水后接入一定的乳酸菌菌種來進行發酵[10-11]。

有機酸是形成泡菜特色酸性風味的物質,泡菜中含有多種有機酸,分別來源于新鮮蔬菜、泡菜發酵過程和食品添加劑[12]。泡菜質量檢測的重要指標之一是有機酸含量的檢測,目前對于泡菜中有機酸含量測定的文獻較少,王冉等[13]用反相高效液相色譜(reversed-phasehigh performance liquid chromatography,RP-HPLC)法測定泡菜中的有機酸;張坤等[14]用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)同時測定泡椒中的6種有機酸;鄒輝等[15]以白菜為原料自然腌制泡菜,采用高效液相色譜法和分光光度法,測定腌制過程中有機酸的種類及含量、亞硝酸鹽的含量,并進行有機酸對亞硝酸鹽降解實驗,研究了泡菜中有機酸及其對亞硝酸鹽含量的影響。

本試驗采用高效液相色譜法對自然發酵、純種發酵、自制泡菜菌發酵和老泡菜水發酵4種不同發酵方式制作的甘藍泡菜中的有機酸進行測定,比較不同發酵方式生產的泡菜中各有機酸種類和含量的差異,以期為泡菜生產工藝的深入研究提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(卷心菜):運城市佳緣超市;泡菜乳酸菌發酵粉:北京川秀科技有限公司制造;高粱酒(53%vol):山西省春玉酒業有限公司;磷酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為分析純)、甲醇(色譜純):天津市大茂化學試劑廠;草酸、檸檬酸、丙酸、琥珀酸、DL-蘋果酸、乳酸、酒石酸、乙酸、抗壞血酸標準品:美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

LC1200型高效液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm):美國Agilent公司;FHS-3C型pH計:上海儀電科學儀器股份有限公司;TDL6M型大型離心機:長沙湘智離心機儀器有限公司;TG16MW型臺式高速離心機:湖南赫西儀器裝備有限公司;JJ/2型組織搗碎勻漿機:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ-300GDV型數控超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;FA1604型電子天平:上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制作

甘藍經挑選、整理、清洗、瀝干、切分后裝入泡菜壇中,按照下列不同操作方式分別進行自然發酵、純種發酵、自制泡菜菌發酵和老泡菜水發酵。

自然發酵:按甘藍與食鹽水(食鹽水質量濃度為6g/100mL,下同)質量比1∶2的比例裝入泡菜壇,密封、室溫發酵。

純種發酵:按甘藍與食鹽水質量比1∶2的比例裝入泡菜壇,同時加入總質量0.3%的泡菜乳酸菌發酵粉,密封、室溫發酵。

自制泡菜菌發酵:將高粱酒(53%vol)與食鹽水按體積比1∶20混合,然后加入總質量5%的青椒,密封、室溫發酵5～6 d,待青椒變黃后,自制泡菜發酵菌制成。按甘藍與自制泡菜菌液質量比1∶2的比例裝入泡菜壇,密封、室溫發酵。

老泡菜水發酵:使用以前自然發酵制作泡菜的老泡菜水,按甘藍與老泡菜水質量比1∶2的比例加入到泡菜壇,密封、室溫發酵。

1.3.2 樣品處理

參照楊君等[15-16]的方法并加以改進。準確稱取發酵第7天的甘藍泡菜和汁液各50.0g,一起放入組織搗碎機搗碎成漿,將其作為有機酸、總酸度、pH值等測定的儲備樣品使用。稱取上述儲備樣品5.00g于離心管中,以轉速為4 000r/min離心15 min,準確吸取上清液15 mL加入10 mL超純水,于75℃超聲波處理20min,再以12000r/min離心15min,上清液經0.22μm濾膜過濾至2 mL進樣瓶中待色譜測定。

1.3.3 有機酸測定

(1)色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測器:可變波長掃描紫外檢測器(variable-wavelength ultraviolet detector,VWD);流動相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(3∶97,V/V)(用磷酸調節pH值為2.8);檢測波長:分別對9種有機酸的標準溶液進行全波長掃描(190～400nm),確定樣品的檢測波長;進樣量:10μL;流速:1mL/min;柱溫:室溫。

(2)標準曲線繪制

分別精密稱取草酸、抗壞血酸各18 mg,酒石酸75 mg,蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸各300 mg,琥珀酸700 mg,丙酸3 000 mg,用流動相溶解并定容至50 mL的容量瓶中,得到0.36 mg/mL的草酸、抗壞血酸,6 mg/mL蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸,1.5mg/mL酒石酸,14 mg/mL琥珀酸,60 mg/mL丙酸的混合有機酸母液。將母液用流動相稀釋為2、4、6、8、10、12倍,得到不同濃度梯度的有機酸標準溶液:草酸、抗壞血酸(0.18mg/mL、0.09mg/mL、0.06mg/mL、0.045mg/mL、0.036 mg/mL、0.03 mg/mL)、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸(3 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.6 mg/mL、0.5 mg/mL)、酒石酸(0.75 mg/mL、0.375 mg/mL、0.25 mg/mL、0.188 mg/mL、0.15 mg/mL、0.125 mg/mL)、琥珀酸(7 mg/mL、4.25mg/mL、2.33mg/mL、1.75mg/mL、1.4mg/mL、1.167mg/mL)、丙酸(30 mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、7.5mg/mL、6mg/mL、5mg/mL),經0.22μm濾膜過濾至2mL進樣瓶中,進樣,以峰面積(y)對質量濃度(x)求標準曲線回歸方程和相關系數。

(3)樣品測定

將處理后的樣液進行HPLC分析,進樣量為10μL,采用外標法進行定量。

1.3.4 總酸度測定

采用酸堿滴定法測定總酸(以乳酸計)含量[17],準確稱取上述儲備樣品10 g于250 mL容量瓶中定容,過濾后取濾液50 mL,用0.1 mol/L NaOH標準溶液進行滴定,每個樣液平行3次,求平均值。

1.3.5 pH值測定

采用精密pH計測定[18],準確稱取上述儲備樣品50.0 g,加入10mL蒸餾水,攪拌均勻后進行測定,每個樣液平行3次,求平均值。

1.3.6 數據分析

在Agilent ChemStion工作站,根據色譜圖中樣品的保留時間和標準品的保留時間比對進行定性分析,根據各有機酸的峰面積和標準曲線對樣品中的有機酸進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 有機酸測定結果

2.1.1 有機酸標準混合液HPLC分析

在上述色譜條件下,有機酸混合標準溶液的高效液相色譜圖見圖1。

由圖1可知,9種有機酸分離效果良好,保留時間分別為草酸3.306 min、酒石酸3.737 min,D-蘋果酸4.693 min、乳酸5.179 min、抗壞血酸5.445 min、乙酸5.808 min、L-蘋果酸8.036 min、檸檬酸8.973 min、琥珀酸9.240 min、丙酸12.826 min。

圖1 有機酸混合標樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards

2.1.2 標準曲線回歸方程

將不同濃度梯度的有機酸混合標準溶液進行HPLC分析,對測得值進行相關系數分析和線性回歸分析,結果見表1。

由表1可知,9種有機酸分別在其線性范圍內,相關系數(R2)均＞0.991,結果表明各有機酸的峰面積與質量濃度的線性相關性良好,在此條件下可以很好地測定有機酸的含量。

表1 有機酸標準曲線的線性回歸方程,相關系數及線性范圍Table1 Regression equations,correlation coefficients and linear range of standard curves of organic acids

2.1.3 精密度試驗

將稀釋10倍的有機酸混合標準液連續進樣6次,根據所得峰面積分別計算精密度,結果見表2。由表2可知,9種有機酸的峰面積測定結果相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)范圍為0.004 2%～0.161 2%,表明該方法的精密度良好。

表2 測定方法的精密度試驗結果(n=6)Table2 Results of precision tests of the method(n=6)

2.1.4 重復性試驗

精密稱取純種發酵方式的泡菜樣品6份,按1.3.1節方法處理后,按上述色譜條件進樣分析,測得各有機酸的峰面積,結果見表3。由表3可知,測定結果重復性RSD范圍為0.503%～5.687%,表明該方法的重復性均達到分析的要求。

表3 測定方法的重復性試驗結果(n=6)Table3 Results of repeatability tests of the method(n=6)

續表

2.1.5 回收率試驗

精密稱取以純種發酵方式制作的泡菜和汁液各50.0g,按1.3.2方法制備樣品儲備液。測定每種有機酸樣品儲備液4份,其中1份作為本底,另3份分別添加低、中、高3個水平有機酸標準溶液,分別預處理后進行色譜分析,其中低、中、高3水平每個水平進行3次平行測定,結果見表4。由表4可知,9種有機酸的回收率在94.2%～105.4%之間,說明該方法的準確度較高。

表4 有機酸測定的加標回收率實驗結果Table4 Results of adding recovery rate tests of the organic acids

2.1.6 甘藍泡菜樣品中有機酸的測定結果

在上述色譜條件下,對四種不同發酵方式的甘藍泡菜樣品進行測定,四種不同發酵方式的泡菜樣品的色譜圖分別見圖2,有機酸測定結果見表5。

圖2 自然發酵(A),純種發酵(B),自制泡菜發酵菌發酵(C)及老泡菜水發酵(D)泡菜中有機酸分析的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of organic acid of pickles made by natural fermentation(A),pure-culture fermentation(B),homemade pickles fermentation(C)and aged pickles water(D)

表5 四種不同發酵方式的甘藍泡菜中有機酸含量Table5 Organic acids contents in cabbage pickles by four fermentation methods

由表5可知,自然發酵和純種發酵方式的泡菜中9種有機酸均被檢出,老泡菜水發酵方式的泡菜檢出8種,琥珀酸未被檢測出;自制泡菜發酵菌泡菜檢出7種,琥珀酸和檸檬酸未被檢測出;四種發酵方式的泡菜中有機酸總量從大到小順序為:純種發酵＞老泡菜水發酵＞自制發酵菌發酵＞自然發酵,四種發酵方式泡菜中共有的有機酸有:草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有機酸含量大小順序均為:草酸＞乳酸＞抗壞血酸＞酒石酸＞DL-蘋果酸,這與王冉等[21-23]的研究的結果相似。草酸、抗壞血酸含量高主要是由于蔬菜原料卷心菜本身含有大量的草酸和抗壞血酸,乳酸含量高是由于乳酸菌為泡菜的主要發酵菌,通過乳酸發酵會使乳酸含量增加[24];泡菜中的每種有機酸呈現的酸味特征不同,但均為泡菜的特色風味物質,單一的有機酸口味比較平淡,多種有機酸的共同作用能夠賦予泡菜更加可口的風味[25]。

2.2 泡菜樣品總酸度及pH值測定結果

采用酸堿滴定法和pH計對四種不同發酵方式的泡菜樣品中總酸度和pH值進行測定,結果見表6。

表6 四種不同發酵方式的泡菜總酸度和pH值Table6 Total acidity and pH value of cabbage pickles made by four fermentation methods

由表6可知,四種不同發酵方式的泡菜總酸度在0.76～0.92 g/100 mL范圍內,從大到小順序為:純種發酵＞老泡菜水發酵＞自制泡菜菌發酵＞自然發酵,這與柳建華等[26]研究結果一致,這是由于汁液是泡菜中乳酸菌發酵的主環境,純種發酵的乳酸菌是經過篩選的具有耐酸能力的菌種,老泡菜水是經過較長時間篩選的泡菜水[27],兩者的乳酸菌總數均高于其他兩種發酵方式的乳酸菌總數,且乳酸菌代謝活動比較旺盛,酸的生成速率較快[28]。

四種不同發酵方式的泡菜pH值范圍在3.95～4.73,由大到小順序為:自然發酵＞自制泡菜菌發酵＞老泡菜水發酵＞純種發酵,這是由于純種發酵泡菜的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)M1產酸能力強,生長繁殖快,對pH的耐受能力強,而自然發酵泡菜中發酵啟動慢,原料自身攜帶的發酵乳酸菌產酸能力弱所致[29]。

3 結論

本試驗采用AgilentTC-C18色譜柱,經過精密度(0.0042%～0.161 2%)、重復性(0.503%～5.687%)、回收率(94.2%～105.4%)等方法學的考察,建立了一種HPLC同時測定四種不同發酵方式泡菜中9種有機酸的分析方法,該方法具有簡便、快速、準確、重復性好等優點。應用此方法測定出四種不同發酵方式泡菜中共有的有機酸有7種:草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有機酸含量大小順序為:草酸＞乳酸＞抗壞血酸＞酒石酸＞DL-蘋果酸,不同發酵方式的泡菜中總有機酸量從大到小依次為:純種發酵＞老泡菜水發酵＞自制發酵菌發酵＞自然發酵。