離子色譜測定窖泥中4種有機酸的不確定度評定

胡用軍,劉燕梅,侯 英

(宜賓市產品質量監督檢驗所,四川 宜賓 644000)

白酒在我國有著悠久歷史和文化沉淀。酒中有機酸對酒質有著重要貢獻,可作為酯的前驅物質以及起呈味和穩定酒香氣的作用[1]。而窖泥作為發酵產酒環境,其中有機酸含量具有重要作用,如窖泥中有機酸含量與窖泥優劣和熟化程度有關聯[2-3],進而對酒質產生影響[4]以及作為窖泥質量評價體系的依據之一[5-6]。根據張方等[1]研究,可依據有機酸質量濃度≥10 mg/100 mL的乳酸、乙酸、丁酸、己酸歸為一類,且該4種有機酸可占濃香型白酒總酸的90%以上,研究窖泥中該4種有機酸具有重要意義。有機酸含量測定主要采用氣相色譜質譜聯用儀(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)[7-8]、氣相色譜法(gaschromatography,GC)[9]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[10]、離子色譜法(ion chromatography,IC)[11-12]和毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)[13-14]等方法,其中IC法對無機和有機陰離子具有獨特優勢,可方便、快速測定酒或窖泥中有機酸含量,較GC-MS法和GC法具有對乳酸直接測定優勢,較HPLC法有淋洗液配制簡單且不易受pH值變化影響優勢,較CE法有儀器在實驗室存在的普遍性以至更易進行有機酸測定的優勢。

測量不確定度的定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性[15],是對測量結果有效性的信心的體現,也是對測量過程的分析,是掌握測量過程關鍵點的有效途徑。參考JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表不》[16]、CNASGL06—2006《化學分析中不確定度的評估指南》中基本流程和文獻資料[17-18]來評定離子色譜法對窖泥中乳酸、乙酸、丁酸和己酸4種有機酸含量不確定度,分析了影響窖泥中4種有機酸測量準確性的影響因素,掌握窖泥中4種有機酸含量測量的關鍵控制點,保障測定結果的準確性,為窖泥中有機酸進一步相關研究提供基礎技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸(純度88.2%):北京壇墨質檢科技有限公司;乙酸、丁酸、己酸(純度均為99.5%):天津市光復精細化工研究所;無水乙醇(分析純):成都科隆化學品有限公司;實驗室用水為賽多利斯超純水。

1.2 儀器與設備

IC-1100離子色譜儀(配電導檢測器(electrical conductivity detector,ECD)和氫氧根自動淋洗發生器):美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備溶液:1 000 mg/L。分別準確稱取適量的乳酸、乙酸、丁酸和己酸標準物質,用體積分數為60%乙醇溶液配成1 000 mg/L的標準儲備溶液,該溶液冷藏保存。

混合標準工作溶液:分別吸取標準儲備溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于100 mL容量瓶中,用純水定容,得到標準工作液質量濃度為0、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L。現配現用。

1.3.2 樣品前處理

①試樣制備

取適量鮮窖泥撒在干凈、不吸收水分的玻璃板上,充分混勻,裝入自封袋中,避光冷藏,備用。

②提取[19]

稱取新鮮窖泥25 g于250 mL帶蓋三角瓶中,加入體積分數為60%的乙醇(100-25×水分%)mL,搖勻。在室溫下浸泡1 h,每隔15 min搖動1次。靜置,待泥沉降后,用精密濾紙、傾瀉法將上層溶液過濾于潔凈干燥的50 mL帶蓋三角瓶中。取濾液1 mL于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容,經0.45μm濾膜過濾后測定。

1.3.3 離子色譜條件

分離柱AS-11HC+AG11(4 mm×250 mm);流速:1.4 mL/min;柱溫:40℃;電子俘獲檢測器(electron capture detector,ECD)檢測器溫度:40℃;ASRS 500抑制電流:104 mA;進樣體積:10μL。淋洗液梯度程序見表1。

表1 淋洗液梯度程序Table1 Gradient elution program of eluent

1.3.4 數學模型建立

鮮窖泥中4種有機酸含量計算公式[19]如下:

式中:ωi為鮮窖泥中有機酸i含量,mg/100 g;ρi為鮮窖泥浸出液中組分i含量,mg/L;V為浸出液體積,mL;d為浸出液稀釋系數;m為鮮窖泥質量,g;10為單位換算系數。

參考CNAS-GL06—2006《化學分析中不確定度的評估指南》中A3.5,將重復性視為相對影響,以重復性系數frep形式引入不確定評定數學模型,得到完整模型計算公式如下:

1.3.5 不確定度來源的識別和分析

根據窖泥測量過程和數學模型可識別出測量過程的不確定度來源:重復性系數frep、浸出液中有機酸含量ρi、浸出液體積V、稀釋系數d和鮮窖泥質量m的不確定度。而浸出液中有機酸含量ρi的不確定度又由校準曲線的變動性和配制校準標準溶液的標準溶液濃度所引起的不確定度組成。繪制的因果關系圖見圖1。

圖1 不確定度因果關系Fig.1 Causal relationship of uncertainty

2 結果與分析

2.1 重復性系數frep的不確定度

重復性不確定度包含其他不確定度分量的重復性不確定度,故后面分量不再評定。

對鮮窖泥進行6次獨立重復的測量。對每個測量值,采用JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表不》中貝塞爾公式(3)得到其標準偏差s(x),再利用公式(4)計算有機酸含量平均值xˉ的標準不確定度u(xˉ),重復性系數frep的標準不確定度u(frep)和相對不確定度urel(frep)則由公式(5)、(6)計算得到,結果見表2。

由表2可知,該窖泥有機酸含量中乳酸和己酸相當,其次為乙酸,最低為丁酸。重復性不確定度中乳酸和乙酸相當,丁酸和己酸相當,前者低于或者,但差值較小,大致相當。

表2 重復性試驗結果不確定度(n=6)Table2 Uncertainty of repeatability tests results(n=6)

2.2 鮮窖泥浸出液中4種有機酸含量ρi的不確定度

2.2.1 標準溶液的不確定度

4種有機酸標準溶液p的不確定度由純度Pi、質量mi、體積V的不確定度決定。

(1)純度Pi的不確定度

乳酸為有證標準物質(certifiedreferencematerial,CRM),純度為88.2%,相對擴展不確定度為1%(k=2),則乳酸標準物質的標準不確定度為u(P乳酸)=88.2%×0.01/2=0.44%。

乙酸、丁酸、己酸為色譜標準物質,純度均為99.5%,相對誤差均為0.5%。按矩形分布進行換算,乙酸、丁酸、己酸的標準不確定度為u(P乙酸)=u(P丁酸)=u(P己酸)=0.5=0.29%。

(2)質量mi的不確定度

標準物質采用十萬分之一的天平稱量100 mg,經過查看該天平檢定證書,其稱量誤差為±0.03 mg。天平測量兩次(一次空盤調零,一次稱樣),按照矩形分布,質量mi的標準不確定度為u(m)i=2×0.03=0.035 mg。

(3)體積V的不確定度

標準溶液定容至100 mL容量瓶中。100 mL容量瓶的不確定度來源有兩部分:①容量瓶體積的不確定度,100mL容量允差為±0.10 mL[20],按照矩形分布換算成標準不確定度為0.10=0.0577 mL;②容量瓶和溶液的溫度與矯正時的溫度不同引起的體積不確定度,假設溫差為3℃,對水體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1,則置信概率(P=1.96)時體積變化的區間為±100×3×2.1×10-4=±0.063 mL,轉換成標準不確定度為0.063/1.96=0.032 1 mL。

以上兩項合成得體積V的不確定度為u(V100)==0.58 mL。

2.2.2 校準曲線的不確定度

4種有機酸含量的線性方程見表3,方程采用線性最小二乘法擬合曲線得到。因使用線性最小二乘法擬合曲線程序的前提是假定了橫坐標的量的不確定度遠小于縱坐標的量的不確定度,所以,浸出液中有機酸含量ρi不確定度計算程序僅僅與峰面積有關,而與校準溶液不確定度無關,也不與從同一溶液中逐次稀釋產生必要的相關性。4種有機酸的校準標準溶液的不確定度足夠小以至可以忽略。

因此,工作曲線變動性引起4種浸出液中有機酸含量ρi的標準不確定度計算公式為(7)、(8),計算結果見表3。

式中:S為標準曲線的標準差;b為標準曲線斜率;P為試液的測量次數,6;n為標準曲線溶液的測量次數,5;ρ為被測浸出液中有機酸的質量濃度,mg/L;cˉ為標準曲線溶液中有機酸質量濃度的平均值,mg/L;ci為標準曲線溶液中有機酸含量質量濃度,mg/L。

表3 浸出液中有機酸含量測定結果的不確定度Table3 Uncertainty of determination results of organic acids content in leach liquid

由表3可知,標準溶液的相對標準不確定度中4種有機酸大致相當,區別僅在標準物質純度。標準曲線變動性引起的標準不確定度和相對標準不確定度差別均較大,從大到小依次是丁酸、乙酸、乳酸、己酸,其中丁酸的相對不確定度遠大于其他3種,這主要由含量差別所導致。

2.3 浸出液體積V的不確定度

2.3.1 鮮窖泥中水分含量不確定度

參考HJ613—2011《土壤干物質和水分的測定重量法》對鮮泥中水分相對偏差要求＜5%[21],則當鮮窖泥中水分含量為37.6%時,絕對差值為1.88%。因乃有2次獨立重復的測量要求,按照極差法來評定不確定度,評定公式[16]如下:

通過查找JJG1059.1—2012《測量不確定度評定與表不》中4.3.2.3的表1可知,當n=2時,極差系數C為1.13。故水分測量值的標準不確定度為:

則水分相對不確定度urel(水分)為0.031 3。

2.3.2 乙醇溶液的體積V'的不確定度

加入體積分數為60%乙醇溶液的體積為90.6mL。采用100mL量出式量筒加入90.6mL,由于量筒最小分量為1mL,后面0.6 mL為估讀,誤差在±0.5 mL。所以量筒不確定度來源有三部分:①估讀誤差,按照矩形分布換算成標準不確定度為=0.29mL;②量筒體積不確定度,量筒允差為±1.0mL,按照矩形分布換算成標準不確定度為0.577 mL;③量筒和溶液的溫度與矯正時的溫度不同引起的體積不確定度,假設溫差為3℃,對水體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1,則置信概率(P=1.96)時體積變化的區間為±90.6×3×2.1×10-4=±0.057 1 mL,轉換成標準偏差為0.057 1/1.96=0.029 1 mL。

2.4 浸出液稀釋系數d的不確定度

本實驗中,窖泥浸出液稀釋了200倍,即d=200。稀釋引起的不確定度由0.5 mL分度移液管和100 mL容量瓶的不確定度決定。

(1)0.5 mL分度移液管

0.5 mL分度移液管的標準不確定度主要包括兩部分:①分度移液管體積的不確定度,按制造商給定分度移液管允差為誤差為±0.010mL,按照均勻分布換算成標準偏差為0.0033 mL;②分度移液管和溶液的溫度與校正時的溫度不同引起的體積不確定度,假設溫差為3℃,對水體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1,則95%置信概率(P=1.96)時體積變化的區間為±0.5×3×2.1×10-4=±0.000 3 mL,轉換成標準偏差為0.000 3/1.96=0.000 2 mL。

以上兩項合成得出:

(2)100 mL容量瓶不確定度

100 mL容量瓶的不確定度已在2.2.1節進行了評定,直接引用結果。標準不確定度u(V100)=0.58 mL。

因此,稀釋系數d的相對不確定度計算公式如下:

2.5 質量m的不確定度

窖泥稱量為25 g,采用百分之一的天平,經過查看該天平檢定證書,其誤差為±0.02 g。天平測量兩次(一次空盤調零,一次稱樣),按照矩形分布,質量m的標準不確定度為u(m)=20.023 g,相對不確定度為ur(elm)=0.023/25=0.000 92。

2.6 合成標準不確定度和擴展不確定度

窖泥中4種有機酸含量的合成標準不確定度計算公式如下:

取擴展因子k=2(近似95%的置信概率),則4種有機酸的擴展不確定度計算公式如下:

表4 不確定度分量一覽表Table4 Component list of uncertainty

續表

由表4可知,4種有機酸含量不確定度主要且共同貢獻來自重復性和水分含量不確定度,而乙酸和丁酸含量的不確定度貢獻還有來自標準曲線變動性不確定度,尤其丁酸的標準曲線變動性不確定度貢獻突出,這可能跟所測含量在標準曲線濃度點上位置有一定關系。4種有機酸含量的其他不確定度分量均小于最大不確定度的三分之一,可以忽略。

2.7 分析結果報告

離子色譜測定窖泥中4種有機酸含量的結果為:

ω乳酸=(536±42)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω乙酸=(403±32)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω丁酸=(143±16)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω己酸=(535±42)mg/100 g,k=2包含概率約95%

3 結論

本研究對離子色譜法測定鮮窖泥中4種有機酸含量的不確定度進行了評定。通過評定分析確定影響乳酸和己酸不確定度的主要因素是重復性和水分含量,而影響乙酸和丁酸不確定度的主要因素是重復性、水分含量和標準曲線。這要求鮮窖泥在取樣后應注意樣品保藏并盡快測定,且在4種有機酸含量測定時,應重點控制重復性和標準曲線誤差影響,即需要操作人員水平高,樣品均勻性好,儀器性能佳。本研究結果為窖泥中開展有機酸進一步研究提供了基礎技術支撐。