農(nóng)用抗生素高產(chǎn)菌株的篩選分離及誘變育種

何海燕,覃擁靈*,秦文芳,柳雨珠,武文嬪,何 麟

(1.河池學院 化學與生物工程學院,廣西 宜州 546300;2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室,廣西 宜州 546300)

據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(food and agricultureorganization of the united nation,FAO)統(tǒng)計,每年因植物遭受病蟲害造成的減產(chǎn)平均損失為總產(chǎn)量的10%～15%,其中真菌引起的病害最為普遍,損失也最嚴重,約80%的作物病害是由病原真菌引起的[1]。

農(nóng)用抗生素是指微生物代謝過程中產(chǎn)生的化學物質(zhì),生產(chǎn)上已經(jīng)利用鏈霉素、井岡霉素、滅胞素、梅嶺霉素等來防治植物病害,具有活性較高、環(huán)境相容性較好等優(yōu)點,因此農(nóng)用抗生素受到了廣泛的關(guān)注[2-3]。抗生素如果使用時間長久,就會導致害蟲有耐藥性,影響抗生素的殺蟲效果,篩選產(chǎn)農(nóng)用抗生素新的微生物菌種,對抗生素產(chǎn)物進行分離純化、性質(zhì)研究是農(nóng)用抗生素研究的突破點[4-5]。

本研究通過原生態(tài)環(huán)境取樣篩選獲取抑菌活性高的菌株,通過形態(tài)特征及生理生化實驗鑒定獲取菌株,用不同的誘變方法來篩選得到生長周期較短,發(fā)酵條件要求不高,殺菌活性高的產(chǎn)抗生素突變株。本研究計劃篩選獲取高產(chǎn)農(nóng)用抗生素微生物菌種,完成菌種鑒定及發(fā)酵條件初步優(yōu)化,為農(nóng)用抗生素的運用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與樣品

厚垣鐮孢霉(Fusarium chlamydosporum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus):本實驗室保存。

菌種土樣:從河池市宜州區(qū)原生態(tài)保持好的山上采集土樣進行篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)觀察培養(yǎng)基:高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、克氏合成一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基;生理生化反應培養(yǎng)基:明膠液化反應培養(yǎng)基、牛奶凝固胨化培養(yǎng)基、淀粉酶水解測定培養(yǎng)基、纖維素分解培養(yǎng)基、柴斯納培養(yǎng)基、碳源利用試驗培養(yǎng)基:按照參考文獻[6-7]自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-2112F雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器:上海智城分析儀器制造有限公司;SW-CJ-1F超凈工作臺:蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Micro-fuge20R高速冷凍離心機:美國貝克曼庫爾特有限公司:HVE-50超高壓滅菌鍋:日本Hirayama公司;DHG-9075A電熱鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司;JA2003B電子天平:上海越平科學儀器有限公司;ST2100實驗室pH計:奧豪斯儀器(常州)有限公司;Research plus單道可調(diào)移液器:德國艾本德股份有限公司;BX51通用熒光顯微鏡:日本奧林巴斯顯微鏡公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的篩選

采集的土樣在研缽內(nèi)研磨均勻,制成10-3～10-6的土壤稀釋液后備用。分別取上述稀釋液0.2mL,分別滴加入冷卻的高氏一號培養(yǎng)基(添加3%重鉻酸鉀)平板上,并涂布均勻,28℃條件下培養(yǎng)7d。長出菌后,反復劃線至長出單菌落。

將厚垣鐮孢霉菌懸液接種于PDA平板上,平皿中間放入篩選獲得的菌餅。培養(yǎng)1 d,有抑菌圈的,測量其抑菌圈的直徑,優(yōu)選抑菌活性較好的菌株。

1.3.2 菌株發(fā)酵液對多種病原菌的抑菌作用

釆用黃豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選菌株,用以上四種供試菌種作為指不菌,采用牛津杯法(內(nèi)徑為6.0 mm,高為10.0mm)測定其發(fā)酵液的抑菌活性,抑菌圈直徑＞6.0 mm表明其具有抑菌活性,且抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越大。

1.3.3 菌種的培養(yǎng)形態(tài)觀察[6-7]

將純化過后的菌種接在查氏培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、克氏合成培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Emerson培養(yǎng)基上,菌種長好后顯微鏡觀察菌種生長情況。

1.3.4 生理生化特性[6-7]

對菌種進行明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉酶的活性、纖維素生長試驗、硫化氫試驗、碳源的利用生理生化試驗。

1.3.5 紫外誘變[8-10]

(1)菌懸液的制備

取篩選獲得的出發(fā)菌株移接新鮮斜面培養(yǎng)基,適宜溫度培養(yǎng)24～48 h,取已培養(yǎng)活化斜面一支,用10 mL生理鹽水將菌苔洗下,取4 mL于5 mL離心管中,于3 000 r/min條件下離心15 min,棄上清液,將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次,最后制成菌懸液并倒入盛有玻璃珠的錐形瓶中,強烈振蕩10 min制成單菌懸液,用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為108CFU/mL。

(2)紫外誘變

正式照射前開啟紫外燈預熱30 min。取制備好的菌懸液5 mL移入6 cm的無菌培養(yǎng)皿中,放入無菌磁力攪拌捧,置磁力攪拌器上,20 W紫外燈下30 cm處。然后打開皿蓋邊攪拌邊照射,時間分別為 20 s、30 s、40 s、50 s和 60 s。紫外照射需在紅燈條件下進行。將照射過的各組孢子懸浮液用無菌水以10倍梯度稀釋法稀釋,從10-3、10-4、10-5這三個稀釋度中分別取200μL均勻涂布于平板上,每批涂布3乃平板,設(shè)置空白對照,28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d。觀察菌落并計數(shù)菌落數(shù),計算紫外誘變致死率,其計算公式如下:

將致死率在80%左右時間紫外誘變處理培養(yǎng)好的單菌落挑出接種于斜面上,28℃條件下培養(yǎng)7 d至孢子成熟,作初篩使用。

(3)紫外誘變初篩

將培養(yǎng)好的待篩選的菌株斜面標號,接種于含60 mL黃豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶,每支一瓶。在28℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 d。取出5 mL發(fā)酵液與10 mL丙酮混合,充分振蕩,過夜。4℃、6 000 r/min條件下冷凍離心,得到澄清的菌絲體丙酮浸提取液,待用。將上述得到的提取液分別和稀釋到萬分之一的吐溫80以1∶4(V/V)混合得到待測藥品。采用牛津杯法測定菌株抑菌圈直徑。抑菌實驗分空白組、陽性組、陰性組,抑菌率計算公式如下:

(4)紫外誘變復篩及遺傳穩(wěn)定性實驗

將第一次篩選得到的抑菌效果最好(抑菌圈直徑最大)的菌株,再次以初篩發(fā)酵條件對其進行搖瓶發(fā)酵。每株3瓶,每瓶裝樣60 mL。在28℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 d。取出5 mL發(fā)酵液與10 mL丙酮混合,充分振蕩,過夜。4℃、6 000 r/min條件下冷凍離心,得到澄清的菌絲體丙酮浸提取液。供試液用上述4種供試菌進行抑菌活性測試,48 h后觀察并統(tǒng)計結(jié)果。對復篩得到的株菌進行穩(wěn)定性遺傳培養(yǎng):分為三代,對每代菌種進行搖瓶發(fā)酵,用發(fā)酵液做抑菌實驗,記錄每代的抑菌情況。

1.3.6 重金屬激活沉默基因誘變[11-13]

挑取孢子成熟復篩選菌約半支斜面量的菌苔于30 mL無菌水中,振蕩均勻過濾,去除菌絲體,制成孢子懸浮液。從10-3、10-4、10-5這三個稀釋度懸浮液中分別取100μL涂布于含AgNO3、CoCl2不同濃度的固體培養(yǎng)基上,28℃條件下黑暗培養(yǎng)7～10 d。將培養(yǎng)成熟的單菌落接種在高氏一號斜面培養(yǎng)基上,一共分為兩組。28℃條件下培養(yǎng)10 d待孢子成熟,備用。

挑取孢子成熟復篩選菌約半支斜面量的菌苔于30 mL無菌水中,振蕩均勻過濾,去除菌絲體,制成孢子懸浮液。將處理過的孢子懸浮液依次涂布于含有不同濃度的選擇壓力重金屬CoCl2、AgNO3的固體培養(yǎng)基上,28℃條件下培養(yǎng)10 d,選取生長較好的菌種接種在高氏一號斜面培養(yǎng)基上。

1.3.7 重金屬激活沉默基因誘變初篩

將培養(yǎng)好的待篩選的菌株斜面標號,接種于含60 mL黃豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶,每支一瓶。條件為28℃、200r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 d,得到濃稠的發(fā)酵液。取出5 mL發(fā)酵液與10 mL丙酮混合,充分振蕩,過夜。在4℃、6 000 r/min條件下冷凍離心,得到澄清的菌絲體丙酮浸提取液。將提取液分別和稀釋到萬分之一的吐溫-80以1∶4(V/V)混合得到待測藥品,采用牛津杯法測量抑菌圈的相對直徑。

1.3.8 重金屬激活沉默基因誘變復篩及遺傳穩(wěn)定性實驗

將初篩得到的抑菌效果最好的菌株,再次以初篩發(fā)酵條件對其進行搖瓶發(fā)酵復篩。每株3瓶,每瓶裝樣60 mL。取出5 mL發(fā)酵液與10 mL丙酮混合,充分振蕩,過夜。4℃、6 000 r/min條件下冷凍離心,得到澄清的菌絲體丙酮浸提取液。將提取液分別和稀釋到萬分之一的吐溫-80以1∶4(V/V)混合得到待測藥品。用上述4種供試菌進行抑菌活性測試。48 h后觀察并統(tǒng)計結(jié)果,對復篩得到的株菌進行三代穩(wěn)定性遺傳培養(yǎng),記錄每代的抑菌情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果

采用添加3%重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基,從采集土壤樣品中篩選出8株菌種,編號為1#～8#。以厚垣鐮孢霉作為指不菌,篩選菌株發(fā)酵液對厚垣鐮孢霉的抑菌作用實驗結(jié)果見圖1。由圖1可知,菌株2#、4#～8#均對厚垣鐮孢霉無抑菌作用;菌株1#和3#對厚垣鐮孢霉產(chǎn)生抑制作用,其中1#菌株抑菌圈較大,表明該菌產(chǎn)較多抑菌活性物質(zhì),具有較好開發(fā)潛能,因此選用菌株1#進一步開展實驗。

圖1 篩選菌株1#(a)及3#(b)對厚垣鐮孢霉的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of screened strain 1#(a)and 3#(b)on Fusarium chlamydosporum

2.2 菌株1#抗菌譜測定

分別用以上4種供試菌為指不菌,對菌株1#進行抗菌譜測定,結(jié)果見圖2。由圖2可知,菌株1#對4種指不菌都有抑菌活性,對厚垣鐮孢霉、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為12.46 mm、18.84 mm、13.40 mm、15.20 mm。鐮孢屬是一種引起多種植物病的真菌,如引起棉花枯萎的尖鐮孢萎焉專化型,水稻惡苗病以及小麥赤霉病的禾谷鐮孢等。金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌,是革蘭氏陽性菌的代表,可引起許多嚴重感染。結(jié)果表明,菌株1#抗菌譜顯不該菌具有殺蟲及抑制人體致病菌的潛能。

圖2 菌株1#發(fā)酵液對4種指不菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of the fermentation broth of strain 1#on the four kinds of indicator microbes

2.3 菌株1#培養(yǎng)特征及生長情況

采用光學顯微鏡觀察菌株1#培養(yǎng)特征,結(jié)果見圖3。由圖3可知,菌株1#的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲比較發(fā)達,產(chǎn)生的營養(yǎng)菌絲發(fā)育良好且有分枝,細胞呈橢圓狀,有隔膜。

圖3 菌株1#的菌絲形態(tài)Fig.3 Mycelium morphology of strain 1#

菌株1#在不同培養(yǎng)基的生長情況見表1。由表1可知,菌株1#在Emerson和察氏瓊脂培養(yǎng)基生長較好且孢子豐富,在馬鈴薯培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基生長較差,孢子呈棉絮狀,菌株菌落不規(guī)則,且邊緣相對整齊,黃色,表面光滑;在克氏合成一號、察氏瓊脂、Emerson培養(yǎng)、馬鈴薯培培養(yǎng)基氣生菌絲為直行、白色;其他兩種培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)生氣生菌絲;在所有的培養(yǎng)基中菌產(chǎn)生基內(nèi)菌絲顏色為黃色或淡黃色;在克氏合成一號、察氏瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生白色的可溶性色素,在Emerson培養(yǎng)則為黃色,其他培養(yǎng)基無可溶性色素產(chǎn)生。

表1 菌株1#在不同培養(yǎng)基上的生長情況Table1 Growth situations of strain 1#on different mediums

2.4 菌株1#生理生化特征

菌株1#生理生化實驗結(jié)果見表2。由表2可知,菌株1#能夠分解淀粉,可以使明膠融化速度較快,能夠讓牛奶凝固胨化,不能分解纖維素,可產(chǎn)生硫化氫,能夠利用蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖。通過對菌株形態(tài)觀察、生理生化實驗等方面的鑒定,參考《鏈霉菌鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》可以初步鑒定菌株1#為鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)[14-15]。

表2 菌株1#的生理生化實驗結(jié)果Table2 Results of physiological and biochemical experiments of strain 1#

2.5 菌株1#紫外誘變及遺傳穩(wěn)定性[6-7]

將菌種用15 W的紫外燈分別處理20 s、30 s、40 s、50 s和60s,結(jié)果表明,隨紫外照射的時間越長菌種致死率越大,在50 s的時候致死率已達到83.4%,時間在60 s的時候致死率已經(jīng)達到了94.3%。放線菌歸屬于原核微生物,原核微生物紫外誘變實驗一般選擇致死率80%開展,本課題選用50s的菌種進行紫外線誘變實驗。

50s處理過的菌株1#,分別用以上4種供試菌為指不菌,對菌株1#進行抑菌活性測定,結(jié)果見表3。由表3可知,經(jīng)紫外誘變過后的菌株1#對厚垣鐮孢霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌活性,并且對厚垣鐮孢霉和枯草芽孢桿菌的抑制率分別增長19.02%和20.41%。

表3 菌株1#紫外誘變前后抑菌圈直徑比較Table3 Comparison of inhibitory zone diameter of strain 1#before and after UV-mutation

菌株1#紫外誘變后遺傳穩(wěn)定實驗結(jié)果見表4。由表4可知,菌種在經(jīng)過三代的連續(xù)培養(yǎng)后,每一代對供試菌的抑菌圈直徑都＞10 mm。依然保持了很好的穩(wěn)定性,可以作為后續(xù)研究工作的出發(fā)菌株。

表4 菌株1#紫外誘變遺傳穩(wěn)定性Table4 Genetic stability of strain 1#after UV-mutation

2.6 菌株1#重金屬激活沉默基因誘變及遺傳穩(wěn)定性[8-10]

分別用以上4種供試菌為指不菌,菌株1#重金屬激活沉默基因誘變前后抑菌圈直徑比較結(jié)果見表5。由表5可知,菌株1#對厚垣鐮孢霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性分別增加了25.68%、32.11%、34.85%、28.28%。

表5 菌株1#重金屬激活沉默基因誘變前后抑菌圈直徑比較Table5 Comparison of inhibitory zone diameter of strain 1#before and after mutation with heavy metal activating silent genes

菌株1#重金屬激活沉默基因誘變遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表6。由表6可知,在經(jīng)過三代的連續(xù)遺傳對四種指不菌都保持著較好的穩(wěn)定的抑制活性,其中重金屬激活沉默基因誘變菌株1#對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都＞20 mm,對厚垣鐮孢和大腸桿菌的抑菌直徑都＞10 mm。

表6 菌株1#重金屬激活沉默誘變遺傳穩(wěn)定性Table6 Genetic stability of strain 1#after mutation with heavy metal activating silent genes

3 結(jié)論

本研究從河池市宜州區(qū)原生態(tài)保持好的山上采集土樣,篩選獲得一株產(chǎn)抗生素能力較強的菌株1#。對該菌種進行了培養(yǎng)觀察,依據(jù)顯微形態(tài)、生理生化特征等實驗,可初步鑒定菌株1#為鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)。菌株1#對厚垣鐮孢霉抑菌圈直徑12.46 mm、金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑15.84 mm、枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑19.40 mm,對大腸桿菌抑菌圈直徑13.20 mm,對上述4種菌均有抑制作用。

通過對菌株1#進行紫外誘變和重金屬激活沉默基因復活誘變兩輪誘變處理,菌種對對厚垣鐮孢霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑制作用分別增加了25.68%、32.11%、34.85%、28.28%。且經(jīng)過二輪誘變處理的菌株生長周期較短、發(fā)酵條件要求不高及抑菌活性較好,誘變后菌株1#遺傳穩(wěn)定性好。