響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵藍(lán)莓果醋發(fā)酵工藝條件

陳 曦,李國(guó)林,陳夢(mèng)玉,黃道梅,孟繁博,鄭秀艷,林 茂*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所,貴州 貴陽(yáng) 550006;2.貴州金農(nóng)輻照有限責(zé)任公司,貴州 貴陽(yáng) 550006)

藍(lán)莓(blueberry)為杜鵑花科越橘屬植物。藍(lán)莓果實(shí)甜酸適度、口感佳,含有大量對(duì)人體健康有益的成分,其中富含芍藥素、矮牽牛素等多種花青素成分,具有良好的抗氧化能力。藍(lán)莓中所含有的單寧類物質(zhì)可以有效抑制消化系統(tǒng)的不良癥狀[1-2]。1989年我國(guó)開(kāi)始從美國(guó)、加拿大等地引種70余個(gè)品種藍(lán)莓,2008年以后貴州種植藍(lán)莓面積快速增長(zhǎng),據(jù)2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),僅貴州黔東南苗族侗族自治州累計(jì)種植藍(lán)莓達(dá)12.8萬(wàn)km2,成為中國(guó)最大人工種植藍(lán)莓地區(qū),占全國(guó)種植面積的1/3[3]。藍(lán)莓具有不易保藏、產(chǎn)業(yè)化和利用率低的特點(diǎn)[4-5],因此,貴州藍(lán)莓深加工迫在眉睫。藍(lán)莓發(fā)酵制品的開(kāi)發(fā)一直存在生產(chǎn)工藝不夠完善,發(fā)酵質(zhì)量不夠穩(wěn)定,發(fā)酵效率低的問(wèn)題[6-9]。鑒于此,本研究利用響應(yīng)面法對(duì)藍(lán)莓果醋的醋酸發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,從而確定藍(lán)莓果醋的最佳發(fā)酵條件。果醋發(fā)酵工藝條件經(jīng)優(yōu)化后不但具有果醋的風(fēng)味和口感,還保留了藍(lán)莓本身的花青素、維生素、氨基酸等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。使得消費(fèi)者更易接受的同時(shí)擴(kuò)大消費(fèi)領(lǐng)域,也為藍(lán)莓果醋的開(kāi)發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

藍(lán)莓酒(酒精8.2%vol,pH 4.26):貴州省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所自制產(chǎn)品;滬釀1.01醋酸菌:上海釀造一廠。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、酵母膏、瓊脂(均為生化試劑):生工生物工程(上海)股份有限公司;碳酸鈣、氫氧化鈉(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌試管斜面培養(yǎng)基[10]:酵母膏1%,葡萄糖1%,瓊脂粉2%,碳酸鈣1.5%,在121℃、0.1MPa條件下滅菌20min。

醋酸菌液體種子培養(yǎng)基[11]:酵母膏1%,葡萄糖1%,碳酸鈣1.5%,在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HT-24X2H恒溫振蕩培養(yǎng)器:上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司;SW-CJ-1C無(wú)菌工作臺(tái):無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司;LH-J80酒精度儀:上海樊克生物科技有限公司;雷磁PHS-25型酸度計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓醋加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn):按比例加入無(wú)菌水調(diào)整成不同酒精度、不同pH值的藍(lán)莓酒后,巴氏滅菌溫度為75℃,維持15 min,進(jìn)行滅菌處理,將體積分?jǐn)?shù)20%的藍(lán)莓酒裝入250 mL錐形瓶中,按體積分?jǐn)?shù)15%的接種量接入醋酸菌活化液,用紗布封口,在轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度為30℃條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵,時(shí)間5 d,利用60Co-γ輻照劑量為1 000 Gy,且以3～4 Gy/min的劑量率進(jìn)行輻射,輻射后陳釀15 d,用膜過(guò)濾設(shè)備進(jìn)行澄清處理后,在121℃條件下進(jìn)行超高溫瞬時(shí)滅菌30 s。

1.3.2 藍(lán)莓果醋的醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)

通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,擬采用初始pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、初始酒精度(5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol)、發(fā)酵時(shí)間(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)、轉(zhuǎn)速(160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min)、發(fā)酵溫度(26 ℃、28℃、30℃、32℃、34℃)這5個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),以藍(lán)莓果醋醋酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。篩選出對(duì)藍(lán)莓果醋影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),所做試驗(yàn)均重復(fù)3次。

(2)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,以醋酸產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,選取4個(gè)影響較大的因素發(fā)酵時(shí)間(A)、初始pH值(B)、轉(zhuǎn)速(C)、初始酒精度(D)進(jìn)行藍(lán)莓果醋醋酸發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),采用Design-Expert軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì),將得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,所做試驗(yàn)均重復(fù)3次。響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測(cè)

pH測(cè)定:用pH計(jì)測(cè)定;酒精度測(cè)定:酒精密度瓶法,按國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的方法測(cè)定[12]。

醋酸產(chǎn)量的測(cè)定采用酸堿定法:取1 mL的發(fā)酵液于250 mL錐形瓶中,加入蒸餾水20 mL,用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定至pH值8.2,并計(jì)算醋酸產(chǎn)量[13]。醋酸含量計(jì)算公式如下:

式中:X為樣品中醋酸產(chǎn)量,g/100 mL;c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L;V0為空白實(shí)驗(yàn)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V1為樣品滴定時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;0.06為1 mol NaOH相當(dāng)于醋酸的質(zhì)量,mg。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin8.0軟件處理軟件對(duì)進(jìn)行處理和分析;響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)分析利用Design Expert17.0設(shè)計(jì)軟件;顯著性差異分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵藍(lán)莓果醋工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始pH值對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響

醋酸菌的繁殖速度和產(chǎn)酸能力受初始pH值的影響,初始pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng),致使醋酸產(chǎn)量低[14]。由圖1可知,當(dāng)初始pH值在3.0及5.5時(shí),醋酸菌生長(zhǎng)緩慢,致使產(chǎn)酸效率低,總產(chǎn)量也低于其他初始pH值組。當(dāng)初始pH值在3.5～4.5之間時(shí),醋酸菌在此pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)迅速,產(chǎn)酸能力強(qiáng),積累的醋酸量較多。因此,響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)選取pH值為3.5～4.5。

圖1 不同初始pH值對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different initial pH values on blueberry vinegar fermentation

2.1.2 轉(zhuǎn)速對(duì)藍(lán)莓醋發(fā)酵的影響

醋酸菌作為好養(yǎng)微生物,在氧氣充足時(shí),其生理代謝活動(dòng)旺盛,產(chǎn)醋酸量快。由圖2可知,發(fā)酵0～5 d,轉(zhuǎn)速越高,產(chǎn)酸變化幅度越大,說(shuō)明轉(zhuǎn)速越高,醋酸菌產(chǎn)酸能力越強(qiáng);發(fā)酵到5～7 d,不同轉(zhuǎn)速下,累計(jì)產(chǎn)酸量相差較小。因此,選擇轉(zhuǎn)速為180～220 r/min。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of rotational speed on blueberry vinegar fermentation

2.1.3 初始酒精度對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,初始酒精度越高,產(chǎn)酸量越多,但酒精度過(guò)高會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng),難以生產(chǎn)醋酸[15]。由圖3可知,在酒精度達(dá)到9%vol時(shí),醋酸菌生長(zhǎng)受到抑制,產(chǎn)醋酸量低;在酒精度為5%vol時(shí),由于酒精量不足以提供醋酸菌生產(chǎn)代謝,故產(chǎn)醋酸量也較酒精度在6%vol～8%vol低;酒精度為6%vol～8%vol時(shí),不僅滿足醋酸菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還保證了醋酸菌的生長(zhǎng)代謝不受抑制,因此,選擇酒精度為6%vol～8%vol。

圖3 不同初始酒精度對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different initial alcohol contents on blueberry vinegar fermentation

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on blueberry vinegar fermentation

微生物乃有在適宜溫度下,生長(zhǎng)速度才最快,代謝時(shí)間最短[16]。醋酸菌在溫度過(guò)低時(shí)發(fā)酵效率低,產(chǎn)酸量少,溫度過(guò)高的話,會(huì)造成醋酸菌老化加快,醋酸產(chǎn)量低[17]。由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),在不同溫度條件下,醋酸菌產(chǎn)酸量逐漸增加,在30℃條件下發(fā)酵,最終醋酸產(chǎn)量最高,為5.48 g/100 mL,經(jīng)數(shù)據(jù)分析,差異性顯著(P＜0.05)。因此,選擇30℃作為最適發(fā)酵溫度。

2.2 Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)

采用Design Expert 17.0軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。固定醋酸發(fā)酵溫度為30℃,根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇發(fā)酵時(shí)間為4～6 d,以發(fā)酵時(shí)間(A)、初始pH值(B)、轉(zhuǎn)速(C)、初始酒精度(D)4個(gè)因素為自變量,醋酸產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)方案,響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。利用Design Expert軟件對(duì)表2進(jìn)行回歸分析,得到醋酸產(chǎn)量對(duì)自變量發(fā)酵時(shí)間(A)、初始pH值(B)、轉(zhuǎn)速(C)及初始酒精度(D)的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

由表3可知,該模型P＜0.000 1,回歸模型方程極顯著;失擬項(xiàng)P=0.054 2＞0.05,不顯著,表明該方程合理可行;決定系數(shù)R2=0.956 5,模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.912 9,說(shuō)明該模型能解釋91.29%響應(yīng)值的變化。

模型方程的一次項(xiàng)A、D的P值均＜0.05,說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間和初始酒精度對(duì)結(jié)果有顯著的影響,且一次項(xiàng)各因素對(duì)醋酸產(chǎn)量影響的大小順序?yàn)?初始酒精度(D)＞發(fā)酵時(shí)間(A)＞轉(zhuǎn)速(C)＞初始pH值(B)。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01,具有極高的顯著性,說(shuō)明醋酸產(chǎn)量的變化相對(duì)復(fù)雜,發(fā)酵時(shí)間、初始pH值、轉(zhuǎn)速、初始酒精度對(duì)醋酸產(chǎn)量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,響應(yīng)面效應(yīng)顯著。該回歸方程的擬合度和可信度均較好,可用于藍(lán)莓果醋醋酸產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)[18]。

經(jīng)軟件Design Expert7.0優(yōu)化,分析得到藍(lán)莓醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間5.13 d、初始pH值4.01、轉(zhuǎn)速202 r/min、初始酒精度6.8%vol,根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到的理論最大醋酸產(chǎn)量為5.75 g/100 mL。

圖5 發(fā)酵時(shí)間、初始pH值、轉(zhuǎn)速和初始酒精度的交互作用對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,initial pH value,rotational speed and initial alcohol content on blueberry vinegar fermentation

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性,同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利,將最佳工藝條件修正為:發(fā)酵時(shí)間5 d、初始pH值4.0、轉(zhuǎn)速202 r/min、初始酒精度7.0%vol,在最佳處理?xiàng)l件下,測(cè)得醋酸產(chǎn)量為5.63g/100mL。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值誤差為3.82%,證明響應(yīng)面法優(yōu)化的藍(lán)莓果醋發(fā)酵工藝是可行的,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),優(yōu)化的醋酸發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間5 d、初始初始pH值4.0、轉(zhuǎn)速202 r/min、初始酒精度7.0%vol、發(fā)酵溫度30 ℃。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)建立的模型準(zhǔn)確有效,可用來(lái)預(yù)測(cè)設(shè)定條件范圍內(nèi)及其周?chē)乃{(lán)莓果醋發(fā)酵工藝參數(shù)。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵所得藍(lán)莓果醋的醋酸產(chǎn)量為5.63 g/100 mL,且具有醋香濃郁、藍(lán)莓典型香氣和色澤的特點(diǎn)。優(yōu)化發(fā)酵工藝后的藍(lán)莓果醋為后續(xù)研究輻照陳香奠定基礎(chǔ)。