酸馬乳源降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離及鑒定

程方方,武 運*,武亞婷,王犁燁,殷 娜,劉維兵,韓婷婷,古麗娜孜

(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊 830052)

我國發(fā)酵辣椒醬歷史悠久,但大多采用自然發(fā)酵法。自然發(fā)酵法存在諸多問題[1],主要表現(xiàn)為亞硝酸鹽積累及品質(zhì)不穩(wěn)定難以企業(yè)化大生產(chǎn)。辣椒在種植過程中由于化肥的使用導致硝酸鹽殘留,發(fā)酵時一些還原菌將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。而亞硝酸鹽可進一步被雜菌轉(zhuǎn)化為致癌的亞硝酸胺[2-4]。亞硝酸鹽形成的根本原因是發(fā)酵過程中微生物生長緩慢,腐敗菌滋生[5]。因此可以通過篩選降亞硝酸鹽能力強、繁殖快的乳酸菌解決此問題。自然發(fā)酵法周期長、產(chǎn)品品質(zhì)受自然條件及菌群結(jié)構(gòu)影響大[6],很難滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。為實現(xiàn)發(fā)酵蔬菜行業(yè)工業(yè)化生產(chǎn),保證產(chǎn)品風味品質(zhì),制備低亞硝酸鹽、風味好的產(chǎn)品,人工接種發(fā)酵成為了研究熱點[7]。辣椒醬發(fā)酵過程的微生物體系以乳酸菌為主[8]。新疆地域廣闊,生態(tài)環(huán)境復雜,少數(shù)民族眾多,這些民族畜牧業(yè)及乳制品加工歷史悠久,使得新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物極為豐富。ISPIRLIH等[9]從酸馬乳中篩選出產(chǎn)不同類型胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)的乳酸菌,RONGJ等[10]從酸馬乳中篩選出免疫調(diào)節(jié)性能好的瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus),另外有些研究[11-14]顯不,酸馬乳中優(yōu)勢細菌為乳桿菌(Lactobaicllus)、堅強腸球菌(Enterococcusdurans)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)等乳酸菌。目前乳酸菌降解亞硝酸鹽的人工接種研究多集中于泡菜和酸菜等產(chǎn)品上,適用于發(fā)酵辣椒醬的降亞硝酸鹽乳酸菌研究較少。

因此,本研究通過從新疆傳統(tǒng)食品酸馬乳中篩選降解亞硝酸鹽能力強、產(chǎn)酸快并發(fā)酵辣椒醬風味好的乳酸菌,對篩選菌株進行形態(tài)觀察、生理生化試驗及16SrRNA分析鑒定,并對其進行酸、膽鹽耐受性分析,以期為辣椒醬專用發(fā)酵劑的開發(fā)提供優(yōu)良菌種,為發(fā)酵辣椒醬的純種發(fā)酵及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸馬乳:新疆塔城烏蘇地區(qū)農(nóng)戶用傳統(tǒng)方法制作而成;MRS肉湯、MRS瓊脂、牛膽鹽培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術有限責任公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉(均為分析純):天津永晟精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

MJX-100B-Z生化培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;TU-1810APC分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司;LDZX-50KBS高壓滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;LE2002E電子天平、FE28 Plus pH計:梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取10 mL酸馬奶于90 mL無菌生理鹽水中,充分混勻,用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋至10-6,選取10-3,10-4,10-5和10-6稀釋度各0.1 mL涂布于MRS瓊脂上,于37℃厭氧培養(yǎng)24 h,隨機挑選菌落,轉(zhuǎn)接到MRS瓊脂平板上,分離純化3次,進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗,選取接觸酶陰性革蘭氏陽性菌4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

將篩選得到的菌于MRS瓊脂平板上活化后挑取單菌落接種于10 mL MRS肉湯中37℃培養(yǎng)24 h,取100μL培養(yǎng)液接種到150 mg/L NaNO2的10 mL MRS肉湯中,37℃培養(yǎng)48 h,參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法測定亞硝酸鹽含量。

亞硝酸鹽標準曲線的繪制:分別吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL 150 mg/L NaNO2MRS肉湯置于10 mL棕色容量瓶中。加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL,混勻,靜置5 min后加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液,加水至10 mL刻度,混勻,靜置15 min,以零管校零,于波長538 nm處測定吸光度值OD538nm,繪制亞硝酸鈉標準曲線。

樣品的測定:吸取適量菌液經(jīng)0.12μm濾徑的注射過濾器過濾,取1 mL濾液于10 mL棕色容量瓶中,后續(xù)步驟同標準曲線的操作方法。按照亞硝酸鈉標準曲線回歸方程計算樣品中亞硝酸鹽含量。

菌株的亞硝酸鹽降解率計算公式如下:

式中:C0為MRS肉湯初始NaNO2質(zhì)量濃度,mg/L;C1為根據(jù)標曲回歸方程得出的樣品NaNO2質(zhì)量濃度,mg/L;10為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3 產(chǎn)酸快的乳酸菌篩選

將篩選得到的菌株于MRS瓊脂平板上活化一次后挑取單菌落接種于10 mL MRS肉湯中37℃培養(yǎng)24 h,測定其pH值,篩選產(chǎn)酸快的乳酸菌。

1.3.4 發(fā)酵辣椒醬的工藝流程及操作要點

操作要點:食鹽5%,蒜4%,接種量2.5%。將鮮辣椒洗凈,去蒂及籽切碎,蒜剁碎,稱400 g辣椒并加入蒜末、菌液、食鹽,裝瓶混勻密封,28℃條件下發(fā)酵一定時間。第4天開始每天無菌取樣進行總酸的測定及感官評價。按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1070—2016《辣椒醬》中規(guī)定總酸≤2 g/100 g,根據(jù)預試驗結(jié)果辣椒醬發(fā)酵8 d總酸達到2 g/100 g,可認為發(fā)酵成熟。

1.3.5 分析檢測

發(fā)酵辣椒醬總酸含量的測定參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法;發(fā)酵辣椒醬的感官評價請10人組成的感官評價小組對辣椒醬進行感官評分,取平均值作為評分結(jié)果,具體評分標準見參考文獻[5]。

1.3.6 菌株鑒定

(1)形態(tài)觀察及生理生化鑒定

將分離純化菌株劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,觀察菌株菌落形態(tài),同時進行革蘭氏染色鏡檢觀察細胞形態(tài)。菌株的生理生化試驗參照文獻[15-16]及《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[17]進行。

(2)16SrRNA鑒定

送至華大基因進行測序,序列結(jié)果在美國國家生物技術信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站用基本地方調(diào)整搜尋工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對,選取同源性高的模式菌利用MEGA6.0軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建發(fā)育樹,自展值設定為1 000。

1.3.7 菌株酸和膽鹽耐受性研究

(1)菌株酸耐受性測定

將活化好的菌株按2%接種量接種于pH 3.0的MRS肉湯中于37℃培養(yǎng)6 h,取0 h及6 h樣品采用傾注法進行計數(shù),測定酸耐受性。

(2)菌株膽鹽耐受性測定

將活化好的菌株按2%接種量接種于含0.3%膽鹽的MRS肉湯中于37℃培養(yǎng)6 h,取0 h及6 h樣品采用傾注法進行計數(shù),測定其膽鹽耐受性。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel及Sigmaplot 10.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從烏蘇市3家農(nóng)戶家中自制的酸馬乳中分離出183株菌,按照農(nóng)戶姓氏對菌株進行編號。乳酸菌一般為革蘭氏陽性、過氧化氫陰性菌,因此進行革蘭氏鏡檢及過氧化氫酶試驗,其中28株菌革蘭氏染色為陽性、過氧化氫試驗為陰性,可作為初步分離的乳酸菌。

2.2 乳酸菌初篩

2.2.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

以亞硝酸鈉質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制亞硝酸鹽標準曲線如圖1所不,所得標準曲線回歸方程為:y=0.054 1-0.032 8x,相關系數(shù)R2=0.992 1,擬合度較好,能夠應用于樣品中亞硝酸鹽含量的測定。

圖1 亞硝酸鈉標準曲線Fig.1 Standard curve of sodium nitrite

2.2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

所篩28株菌亞硝酸鹽降解率見表1。由表1可以看出,28株乳酸菌均具有亞硝酸鹽降解能力,但菌株間亞硝酸鹽降解能力差異明顯(3.60%～88.91%)(P＜0.05),其中有5株乳酸菌亞硝酸鹽降解率＞80%,其中菌株C27亞硝酸鹽降解率達到88.91%,與已報到[18]的大部分乳酸菌亞硝酸鹽降解率(20%～90%)相比較高。本試驗選擇亞硝酸鹽降解率＞50%的9株菌(E47、E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3、C11)進行下一步菌株的篩選。

表1 新疆酸馬乳中亞硝酸鹽降解菌株的初篩Table1 Primary screening of nitrite-degrading strains isolated from Xinjiang kumiss

續(xù)表

2.2.3 產(chǎn)酸快的乳酸菌篩選

乳酸菌快速產(chǎn)酸使發(fā)酵液pH迅速降低,抑制有害菌[8]是發(fā)酵制品的關鍵技術。產(chǎn)酸速度不僅是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標[19],也反應了菌株的繁殖快慢。28株菌培養(yǎng)24 h的pH測定結(jié)果見表2。

表2 新疆酸馬乳中初篩菌株發(fā)酵液24 h時的pH值Table2 pH value of fermentation liquor of primary screening strains isolated from Xinjiang kumiss for 24 h

由表2可知,菌株C18發(fā)酵24 h的發(fā)酵液pH為4.2,有16株菌的發(fā)酵液pH＜4.5。綜合產(chǎn)酸能力(篩選標準pH≤4.5)及亞硝酸鹽降解能力,最終篩選出菌株E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3和C11進行復篩。乳酸菌一般通過產(chǎn)酸和產(chǎn)酶兩種途徑降亞硝酸鹽,本研究中的28株菌中pH在4.2～4.3之間的12株菌,乃有3株菌降解亞硝酸鹽能力強(降解率≥80%),這說明不是產(chǎn)酸強的乳酸菌降解亞硝酸鹽能力就強,這4株菌降解亞硝酸鹽的主要機制可能是酶降解,但還需進一步試驗驗證。

2.3 乳酸菌復篩

2.3.1 發(fā)酵辣椒快的乳酸菌篩選

為了篩選辣椒醬專用菌,將篩選出的菌種接種于辣椒醬進行發(fā)酵,根據(jù)辣椒醬中總酸含量可以判斷菌株發(fā)酵辣椒的快慢,本試驗將篩選出的8株菌(E18、C7、C17、E14、C55、C27、C3和C11)接種到辣椒醬中發(fā)酵8 d,比較各菌株發(fā)酵辣椒的能力,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,菌株E18、C17、E14、C27、C3在發(fā)酵過程中總酸含量較高(分別為1.93 g/100 g、1.68 g/100 g、1.74 g/100 g、2.15 g/100 g、1.60 g/100 g),所以選擇這5株菌進行進一步試驗。本研究中自然發(fā)酵樣品發(fā)酵至第8天時總酸含量為1.43 g/100 g,與聶艷輝[8]研究的自然發(fā)酵及人工接種發(fā)酵第9天總酸含量(1.2～1.6g/100g)結(jié)果相同。接種菌株C27的辣椒醬總酸含量一直較高,發(fā)酵第8天達到2.15g/100 g,遠高于其他篩選菌及自然發(fā)酵(比自然發(fā)酵高33.5%、比菌株E18高10.2%),同時也遠高于羅靜等[20]測定的市場上3種發(fā)酵辣椒醬發(fā)酵第6周總酸(1.6 g/100 g),菌株C27可以明顯縮短發(fā)酵時間。

圖2 發(fā)酵辣椒醬中總酸含量的測定結(jié)果Fig.2 Determination results of total acid contents in fermented chilisauce

2.3.2 發(fā)酵辣椒醬感官評價結(jié)果

將篩選出的菌種(E18、C17、E14、C27、C3)接種于辣椒醬進行發(fā)酵,結(jié)果見表3。由表3可知,5個人工接種的發(fā)酵辣椒醬總酸含量均高于自然發(fā)酵,同時感官評分也高于自然發(fā)酵,說明產(chǎn)酸總量直接影響到辣椒醬的風味及品質(zhì),但乳酸的產(chǎn)量與辣椒醬風味并不成線性關系,例如5株菌中菌株E18總酸含量為1.93 g/100 g,感官評分卻最低乃有69分。從表3可以看出,菌株C27感官評分最高,為88分,同時其發(fā)酵第8天的辣椒醬中總酸含量也最高,達到2.15g/100g,說明菌株C27比較適合發(fā)酵辣椒。由菌株C27發(fā)酵的辣椒醬顏色鮮紅,發(fā)酵香味濃郁。因此,選擇菌株C27進行后續(xù)的菌種鑒定。

表3 發(fā)酵辣椒醬發(fā)酵第8天總酸含量及感官評分測定結(jié)果Table3 Determination results of total acid contents and sensory evaluation of fermented chilisauce on the 8th day of fermentation

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)特征

菌株C27的菌落及細胞形態(tài)見圖3。由圖3A可知,菌株C27在MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h形成的菌落邊緣整齊、表面光滑、規(guī)則圓形、中心凸起、乳白色且質(zhì)地均勻有粘性。由圖3B可知,C27菌株革蘭氏染色鏡檢照片顯不C27菌株細胞呈球形,成對或鏈形排列,不形成芽孢。

圖3 菌株C27菌落(A)和細胞形態(tài)(B)Fig.3 Colony(A)and cell(B)morphology of strain C27

2.4 .2生理生化特征

菌株C27生理生化試驗結(jié)果見表4。

表4 菌株C27的生理生化特性Table4 Physiological and biochemical characteristics of strain C27

由表4可知,菌株C27在pH 4.8、10%乙醇中的生長情況、過氧化氫酶及精氨酸水解試驗結(jié)果為陰性,其余試驗項目結(jié)果均為陽性,根據(jù)參考文獻[15-16]及《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[17],菌株C27可能為腸膜明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides)。

2.4.3 16SrRNA序列分析

將菌株C27 16SrRNA序列放入NCBI網(wǎng)站在線核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對,發(fā)現(xiàn)菌株C27和多株腸膜明串珠菌的相似性都在99%。腸膜明串珠菌屬于明串珠菌屬,目前EzBioCloud網(wǎng)站上共有13個種8個亞種明串珠菌模式菌的16SrRNA,分別是:檸檬色明串珠菌(Leu.citreum)、肉明串珠菌(Leu.carnosum)、乳明串珠菌(Leu.lactis)、假腸膜明串珠菌(Leu.pseudomesenterodies)、欺詐明串珠菌(Leu.fallax)、Leu.holzapfelii、Leu.inhae、Leu.kimchii、Leu.miyukkimchii、Leu.palmae、Leu.rapi、JDVA s、EU469745 s、冷明串珠菌3個亞種:Leu.gelidum subsp.aenigmaticum、Leu.gelidum subsp.gasicomitatum、Leu.gelidum subsp.gelidum和腸膜明串珠菌5個亞種:乳脂亞種(Leu.mesenteroides subsp.cremoris)、葡聚糖亞種(Leu.mesenteroides subsp.dextranicum)、腸膜亞種(Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides)、Leu.mesenteroides subsp.jonggajibkimchii、Leu.mesenteroides subsp.suionicum。因此將這些模式菌和菌株C27進行發(fā)育樹構(gòu)建,結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株C27與腸膜明串珠菌(Leu.mesenteroides)在一個聚類上。目前16SrRNA對于近緣菌種的區(qū)分鑒定存在局限性,對于腸膜明串珠菌種的亞種鑒定方法仍在探索中[21-22],因此本試驗結(jié)合菌株形態(tài)學觀察、生理生化特性及16SrRNA基因序列將菌株C27鑒定為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。

圖4 基于16S rRNA構(gòu)建C27菌株和明串珠菌屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain C27 and Leuconostoc strains based 16S rRNA sequences

2.5 菌株耐酸耐膽鹽特性研究

辣椒醬中的乳酸菌要想在人體內(nèi)定植并發(fā)揮作用,必需能夠耐受人體胃腸道的極端環(huán)境。通常進食后人體胃液pH 3～4左右[23],小腸膽鹽含量在0.03%～0.30%[24],因此本試驗將菌株C27分別接種于pH 3.0的MRS肉湯及0.30%膽鹽的MRS肉湯研究其耐酸及耐膽鹽特性,結(jié)果見表5。由表5可知,在低酸及高膽鹽的極端環(huán)境中菌株C27活菌數(shù)均有下降,但下降幅度不大,分別下降14.84%、9.24%。菌株C27在pH 3.0MRS肉湯中培養(yǎng)6h后存活率為85.16%,而0.3%膽鹽的MRS肉湯中存活率達90.76%。若菌株存活率達到80%,則保證有足夠的菌株通過胃到達小腸以發(fā)揮作用[25]。因此,菌株C27有較好的酸及膽鹽耐受性,有望在人體腸胃中定植發(fā)揮作用。

表5 菌株C27酸及膽鹽耐受性結(jié)果Table5 Results of acid and bile salt tolerance of strain C27

3 結(jié)論

本研究以新疆傳統(tǒng)發(fā)酵制品酸馬乳為篩選源進行乳酸菌的篩選,共分離出28株革蘭氏陽性,過氧化氫酶陰性的菌株。菌株經(jīng)測定亞硝酸鹽降解率、24 h發(fā)酵液pH,初步篩選出8株乳酸菌。為進一步篩選辣椒醬專用菌,將菌株分別接種于辣椒醬,根據(jù)總酸含量和感官評價進行菌株復篩。最終篩選出一株菌株C27,其亞硝酸鹽降解率達到88.91%,較目前研究來看亞硝酸鹽降解率處于較高水平[26]。菌株C27發(fā)酵的辣椒醬風味好,且發(fā)酵至第8天時總酸含量達2.15 g/100g,高于目前的1.6g/100 g[8,20]。生理生化特性顯不菌株C27為腸膜明串珠菌腸膜亞種。C27菌株經(jīng)16SrRNA測序,根據(jù)比對結(jié)果,選擇明串珠菌屬的所有種及亞種進行發(fā)育樹的構(gòu)建,結(jié)果顯不菌株C27與腸膜明串珠的亞種在同一分支上,鑒定菌株C27為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。乳酸菌為了發(fā)揮其益生性,適應人體腸胃道的極端環(huán)境是首要條件,菌株C27在pH 3.0及0.3%膽鹽環(huán)境中能夠生長。綜上所述,菌株C27具有較高的應用價值,可為辣椒醬專用發(fā)酵劑提供優(yōu)良菌種。