一株海藻酸降解菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

王艷華,丁 涓*,李帥軍,景春雷

(魯東大學 生命科學學院,山東 煙臺 264000)

山東省煙臺市長島縣是海帶(Saccharina japonica)的大規(guī)模養(yǎng)殖地區(qū)之一,同時其近岸海域保持了接近原生態(tài)的環(huán)境,保有天然大型海藻組成的海藻場。在這獨特的生境中分布的很多獨特海洋微生物,通過分泌褐藻酸裂解酶能夠分解海帶細胞間質(zhì)和細胞壁中的褐藻酸,這些海洋微生物大量增殖能夠引起多種海帶病害,并造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-2];然而天然褐藻酸以及工業(yè)中廣泛應用的褐藻酸鹽,經(jīng)生物酶降解后得到的褐藻寡糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化作用及抗炎癥增強免疫等活性,此外能夠促進多種植物的根部生長,延長植物生命周期[3]。目前已發(fā)現(xiàn)60多種褐藻酸裂解酶,主要來源于海洋藻類、軟體動物、海洋細菌、陸生真菌及少數(shù)噬菌體和病毒[4-9]。通過富集褐藻附生菌并進行篩選是獲得高產(chǎn)酶量新菌株的有效途徑,具有重要的理論意義和明確的應用前景。本研究以長島縣近岸獨特微環(huán)境中生長海帶的腐爛組織作為材料,篩選出降解褐藻酸的新菌株,運用分子生物學方法鑒定其種屬;并對該菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化,以期為進一步工業(yè)化開發(fā)利用性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)褐藻酸酶的褐藻酸降解菌提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐爛的海帶:山東省煙臺市長島縣南長山島海灘采集,地理坐標為37°55′N,120°44′E,共計0.5 kg,用采樣袋收集。

硫酸鎂,氯化鈉,磷酸氫二鉀(分析純):國藥集團化學試劑有限公司;海藻酸鈉(化學純):天津市河東區(qū)紅巖試劑廠。

篩選培養(yǎng)基:海藻酸鈉6g/L,瓊脂20g/L,NaCl 25g/L,K2HPO42 g/L,MgSO41 g/L,(NH4)2SO42 g/L,pH=7,121℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基:海藻酸鈉6g/L,NaCl25g/L,K2HPO42g/L,MgSO41 g/L,(NH4)2SO42 g/L,pH=7,121℃滅菌20 min[7]。

1.2 儀器與設備

6PX-198F生化培養(yǎng)箱:寧波江南儀器廠;TDL-5離心機:上海隆拓儀器設備有限公司;SW-CJ-1CU超凈工作臺:蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;QYC-211全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器:金壇盛藍儀器有限公司;Gel-Doc2000凝膠成像分析儀:美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻酸降解菌的篩選

在超凈工作臺中,用剪刀剪去海帶腐爛組織盛放于培養(yǎng)皿,用適量無菌水將培養(yǎng)皿中的樣品反復清洗3次,用移液槍吸取菌液稀釋10 000倍。吸取上述稀釋的菌液200μL,再涂布到配制好的篩選培養(yǎng)基內(nèi)[10]。在生化培養(yǎng)箱中設置22℃、27℃、32℃溫度梯度,倒置培養(yǎng)72 h。測量得到的單菌落形成的透明降解圈直徑,并記錄菌落特征。選取其中透明降解圈最明顯的菌株作為重點菌株進行研究。

1.3.2 16SrDNA鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

提取目標菌落的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),利用通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)擴增,擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序。將測序結(jié)果進行Blast比對,獲取16SrDNA基因序列同源性最高的菌群,用MEGA7.0中的鄰接(neighbor-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,對其進行分析鑒定。

1.3.3 響應面試驗設計

結(jié)合此菌的實際培養(yǎng)條件和之前報道的相似菌株較優(yōu)的單因素結(jié)果[11-12]。采用Box-Behnken中心組合設計,以溫度(X1)、轉(zhuǎn)速(X2)、pH(X3)、接種量(X4)為自變量,以酶活力(Y)為響應值設計4因素3水平試驗,中心組合試驗方案中的因素及水平如表1所不,數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0進行分析[13-16]。

表1 海藻酸降解菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for enzyme-producing conditions optimization of alginatedegrading bacteria

1.3.4 測定方法

采用之前優(yōu)化過的3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法檢測酶活力[11]。首先將發(fā)酵得到的菌液在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min,取上清液即為粗酶液。將1.0 mL粗酶液與1.0 mL 0.75%褐藻酸鈉溶液(用pH 7.0的磷酸緩沖液配制)混合,40℃水浴反應20 min;反應后的體系中再加入1.5 mL DNS,沸水浴反應5 min,迅速用流動水冷卻;定容,測定波長540 nm處的吸光度值。

酶活力:給定溫度和pH條件下,每分鐘催化產(chǎn)生1μg還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。

比活力:每毫升發(fā)酵液所含的酶活力單位[4,11-12],U/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

經(jīng)過篩選,在22℃條件下篩選得到3個菌落,菌落均成乳白色,表面光滑但無明顯的透明降解圈出現(xiàn);在27℃條件下得到多個菌落周圍有透明降解圈產(chǎn)生,如圖1(a)所不。在32℃條件下,無菌落產(chǎn)生。因此說明最適的培養(yǎng)溫度為27℃,在該溫度條件下得到了能在以海藻酸鈉作為唯一碳源,分泌降解海藻酸鈉的胞外酶能力較強的菌株[11,17-19]。其中菌株B2形成的菌落呈乳白色,圓形,濕潤,并形成最大的透明降解圈,選取菌株B2作為重點菌株,分離單菌落并進行純培養(yǎng)。

圖1 27°C條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的透明降解圈(a)和菌株B2在10×100倍油鏡下的細胞形態(tài)(b)Fig.1 Transparent degradation zones(a)produced at 27℃and cell morphology(b)of strain B2 under 10×100 times oil immersion lens

由圖1(b)可知,菌株B2經(jīng)結(jié)晶紫染色在油鏡下觀察,菌體小而密集,以成對或鏈狀排列,具圓端或方端,堆積排列,成短桿狀,初步判斷是桿菌。

2.2 16SrDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將篩選得到的菌株B2用液體培養(yǎng)基分別在搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設置為27℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min,培養(yǎng)72 h。將10 mL菌液8 000 r/min離心去上清,用試劑盒提取基因組DNA。DNA提取和PCR的電泳結(jié)果及測序結(jié)果見圖2。

圖2結(jié)果顯不,提取的基因組DNA在每個泳道的合理位置都出現(xiàn)了一條清晰的條帶,提取結(jié)果良好的樣品可以用于下一步PCR擴增;PCR擴增出一條約1 500 bp大小的條帶;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過測序得到的16SrDNA序列為1 331 bp。PCR產(chǎn)物序列通過美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information)網(wǎng)站中的Blast程序進行比對,得到Ident值95%以上的菌株近40株,說明與此菌株序列相似的,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的菌株較多,其中登錄號為NR_043733的副球?qū)倬?Paracoccushomiensis)的相似度達到了99%。

圖2 菌株B2的DNA提取結(jié)果(a)、PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果(b)和測序結(jié)果(c)Fig.2 Results of DNA extraction,agarose gel electrophoresis verification of PCR product and sequencing of strain B2

選取19個與菌株B2同源性較高且已定名的菌株的16SrDNA基因序列信息進行序列對比,并截取高重復序列,進行系統(tǒng)發(fā)育分析,通過MEGA7.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖3[6,20-21]。

圖3 基于16S rDNA序列分析的菌株B2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B2 based on 16S rDNA sequence analysis

從圖3可以看出,B2菌株和Paracoccus homiensis(NR-043733)從同一結(jié)點進化而來,說明兩者同為副球?qū)佟Ｍ瑫r菌株B2的進化分枝比Paracoccushomiensis的進化分枝長,說明菌株B2進化距離較遠。Bootstrap檢驗值為99,說明進化樹所表不的兩種菌株之間的進化關系可信。對比已有的報道,Paracoccushomiensis菌株在含有海藻酸鈉的液體和固體培養(yǎng)基中生長良好,并且產(chǎn)生的大量海藻酸裂解酶催化解聚海藻酸鈉。根據(jù)菌株B2和Paracoccushomiensis的16SrDNA基因數(shù)據(jù)的相似性,可以進一步判斷菌株B2屬于副球?qū)?Paracoccus)[22]。

2.3 響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

以溫度(X1)、轉(zhuǎn)速(X2)、pH(X3)、接種量(X4)為考察因素,以酶活力(Y)為響應值,進行響應面試驗設計,試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 海藻酸降解菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗設計與結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments for enzyme-producing conditions optimization of alginatedegrading bacterium

經(jīng)過Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得酶活力為目標函數(shù)的二次回歸方程:Y=43.24+0.31X1+0.25X2+0.25X3+0.22X4-4.13X1X2+5.05X1X3+5.35X1X4+1.32X2X3+。對模型進行回歸分析的結(jié)果見表3。模型的F=15.05,P＜0.000 1,效果明顯,說明該模型顯著;模擬失擬項F=5.27,P=0.061 6＞0.05,表明失擬項不顯著;R2=0.937 7表明線性關系明顯,模式調(diào)整確定系數(shù)0.875 4,證實該模型能闡述87.54%相應值得變化,總體證實響應面效果對試驗吻合情況較好,試驗誤差小。

由圖4可知,任何2個交互因素的響應面都存在最高點;由三維立體圖可以看出,兩兩因素之間的影響均呈基本拋物線型,說明有一個最大值[15-18]。根據(jù)響應面優(yōu)化結(jié)果,影響酶活力的最佳條件理論值為溫度24.8℃,轉(zhuǎn)速146.3 r/min,pH值為7.0,接種量8.44%,理論最高酶活力為44.2 U/mol。為方便實際操作,調(diào)整培養(yǎng)條件為溫度25℃,轉(zhuǎn)速150r/min,pH值為7.0,接種量8%,經(jīng)過3次平行試驗,測得褐藻酸裂解酶的酶活力為43.6 U/mol,與模型預測值的誤差為1.345%,與預測值相吻合。后續(xù)將不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件并對菌株進行改造,來進一步提高此菌株的產(chǎn)酶能力,使之能夠滿足相關產(chǎn)品的工業(yè)化應用要求。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Variance analysis of regression model

圖4 溫度、轉(zhuǎn)速、pH、接種量交互作用對酶活力影響的響應面曲線及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between temperature,rotational speed,pH and inoculum on enzyme activity

3 結(jié)論

通過對病變腐爛的海帶組織上的微生物進行選擇性培養(yǎng)基篩選,對比所產(chǎn)生的透明圈直徑,篩選出了高效降解海藻酸的菌株B2。對此菌株的16SrDNA基因序列進行同源性比對,并通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析進化關系,確定此菌株為副球?qū)?Paracoccus)。利用響應面試驗設計優(yōu)化了該菌株產(chǎn)酶條件。得到最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為溫度25℃,轉(zhuǎn)速150 r/min,pH值為7.0,接種量8%,在此條件下,褐藻酸裂解酶的酶活力為43.6 U/mol。本研究將對褐藻寡糖以及褐藻酸降解酶制劑等海洋來源的高值化產(chǎn)品的開發(fā)與應用產(chǎn)生顯著的作用。