基于內轉錄間隔區序列鑒定濃香型大曲發酵表面霉菌

何宏魁,李靜心*,丁 鋒,王艷麗,劉國英

(安徽古井貢酒股份有限公司,安徽 亳州 236820)

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一,具有悠久的歷史和深厚的酒文化內涵,深受消費者喜愛[1]。其中濃香型白酒具有“綿柔甘洌、芳香濃郁、香味協調、尾凈余長、入口甜、落口綿”的酒體風格,在我國白酒行業中占據主導地位[2]。大曲是白酒生產過程中主要的糖化劑和發酵劑,在釀造過程中起著糖化、生香、發酵、提供微生物的作用,具有“曲為酒之骨”的美稱,可見大曲在發酵中的重要地位[3]。大曲中含有豐富的微生物種群,其中霉菌可以產生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等豐富的酶系,酵母則具有酒精發酵能力及產酯能力,對白酒中酒精及香味物質的產生起著十分重要的作用[4]。

濃香型大曲生產時,培菌期的濕度、溫度都非常適宜于酵母菌和霉菌的生長,部分曲塊在掛衣階段表面長滿霉菌菌絲,有時菌絲生長過于旺盛,導致大曲曲塊通風不暢,不利于后期曲塊水分的蒸發及大曲的成熟。對曲塊表面霉菌進行鑒定,從而了解其是否屬于大曲生產過程中的有利微生物,對大曲的質量控制有重要幫助。目前霉菌的鑒定多通過觀察菌絲體和分生孢子頭的形態,結合菌落形態和生理生化特性,確定霉菌的生物學分類。而大曲表面的菌絲可能是多種霉菌混合體,難以通過形態學觀察、菌落形態和生理生化特性鑒定。

本研究擬采用構建內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)克隆文庫的方法,對大曲生產掛衣階段表面霉菌進行分子生物學鑒定,從而確定表面霉菌的生物學分類,對大曲生產中的質量控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

掛衣階段的曲塊(取樣時間為曲胚進房后的5～7d,此時曲塊處于主發酵期):采自安徽古井貢酒股份有限公司。

核酸純化柱套件、膠回收試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galac topyranoside,X-gal)、T-載體PCR產物克隆試劑盒、酚氯仿異戊醇溶液(25∶24∶1,V/V)、氨芐青霉素:生工生物工程(上海)股份有限公司;Taq酶、E.coli DH5α感受態細胞、LB液體培養基、SOC培養基:大連寶生物工程有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、鹽酸胍、無水乙醇(分析純)、營養瓊脂:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Arktik多功能聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction,PCR)儀:美國Thermo公司;BioSpectrum 610化學發光成像系統:美國UVP公司;G-26C高速冷凍離心機:德國Sartorius公司;DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

使用注射器針頭小心挑取曲塊每面中心少量菌絲,置于2mL離心管中混勻,加入1mL 2%CTAB溶液和0.5g玻璃珠,振蕩離心后轉移上清至新的離心管,加入等體積酚氯仿異戊醇溶液抽提,離心取上清,加入2倍體積的6 mol/L鹽酸胍溶液,混勻后加入核酸純化柱,離心棄濾液,重復步驟直至溶液全部通過核酸純化柱,體積分數70%的乙醇清洗2遍后加入30～50μL無菌水,離心得到DNA溶液,-20℃保存備用。

1.3.2 樣品ITS片段的擴增和純化

本研究采用通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'擴增真菌18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S片段。擴增體系為50μL:DNA模板5μL,10×PCR buffer 5μL,脫氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)Mixture 5μL,引物ITS1和ITS4各1.5μL,TAKARA Taq酶0.5μL,雙蒸水(ddH2O)補齊至50μL。PCR反應條件為95℃預變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,共循環25次;72℃最終延伸10 min。擴增好的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠、180 V電泳20 min,電泳液為1×TAE。在紫外燈下將PCR擴增的ITS片段切下,膠回收試劑盒純化后-20℃保存。

1.3.3 連接、轉化和藍白斑篩選

切膠回收產物使用T-載體克隆試劑盒于16℃連接12h。在100μL感受態細胞中加入10μL連接液,置于冰上放置30 min,42℃熱應激90 s,加入900μL SOC培養基,37℃、200r/min振蕩培養45min。在含氨芐青霉素的營養瓊脂平板上加入10μLIPTG(100mmol/L)和100μLX-gal(20mg/mL)并涂布均勻,放置10～30 min后加入菌液涂布均勻,于37℃恒溫箱中倒置培養過夜。

1.3.4 單克隆鑒定及測序分析

挑取白色菌落至5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中,37℃、200r/min振蕩培養8～12h,采用通用引物M13-47:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'和M13-48:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'進行菌液PCR。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳,所有擴增大小為500～750 bp左右的克隆即為構建的ITS文庫。將文庫中的所有克隆用M13F和M13R兩對引物進行測序,對測序得到的序列進行拼接、去載體、去嵌合體后,使用UNITE數據庫進行比對,從而對大曲表面霉菌組成進行分析。

2 結果與分析

2.1 ITS序列的擴增

大曲表面霉菌ITS序列的PCR擴增結果如圖1所不。

圖1 大曲表面霉菌ITS序列的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of ITS sequence of mold from Daqu surface

由圖1可以看出,PCR產物的片段長度為750 bp左右。

2.2 陽性克隆的檢測和測序

經過藍白斑篩選(見圖2),從ITS克隆文庫中隨機挑選24個白色克隆至5 mL LB培養基中,振蕩培養后用M13F/R引物PCR鑒定,結果表明,24個克隆中共有20個陽性克隆,陽性率為83.33%。將20個陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

圖2 大曲表面霉菌ITS文庫藍白斑篩選結果Fig.2 Blue-white selection results of ITS library of mold from Daqu surface

2.3 霉菌鑒定結果分析

對測序得到的序列進行拼接、去載體、去嵌合體后,按照97%的相似性劃分操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),20個克隆共得到2個OTU,每個OTU選取部分代表性序列,使用UNITE數據庫Blast比對代表序列,所得結果見表1。

表1 大曲表面霉菌ITS文庫OTU的劃分與鑒定Table1 Division and identification of ITS library OTU of mold from Daqu surface

測序結果經比對后發現,19個克隆為米根霉(Rhizopus oryzae),1個克隆為扣囊復膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)。由于酵母菌一般不會形成菌絲,因此可以推測曲塊表面生長的黑色菌絲體為米根霉。

米根霉(Rhizopusoryzae)在生物學分類上屬于毛霉科(Mucoraceae),根霉屬(Rhizopus),是一種非常重要的釀酒微生物,在許多酒曲中都有發現。其在培養基上菌落呈疏松或稠密的絮狀,菌絲最開始呈白色,隨著孢子囊的逐漸成熟慢慢變為褐灰色至黑褐色[5]。在制作大曲的過程中,曲塊表面可觀察到的菌絲體多數就是米根霉,其菌絲與生長在培養基上相似,初為白色,隨著大曲的發酵和成熟逐漸變為灰褐色或黑褐色[6]。

目前許多研究表明米根霉可產生較多的胞外酶和胞內酶,如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、單寧酸酶、植酸酶等可用于工業生產的酶[7-11]。此外,米根霉能夠分泌較高水平的L-乳酸[12-15]、富馬酸[16-17]和乙醇[18-19],其安全性已通過了美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)認證[7]。

3 結論

為了分析濃香型大曲生產時部分曲塊表面生長的霉菌的生物學分類,本研究采用構建ITS克隆文庫的方法,對大曲表面霉菌進行了分子生物學鑒定,結果表明,曲塊表面生長的菌絲體為米根霉(Rhizopusoryzae)。