金針菇液態發酵培養初步研究

丁霄霄,李鳳偉,商曰玲,徐漢億,王 杰,卜雯麗,余曉紅*

(1.鹽城工學院 海洋與生物工程學院,江蘇 鹽城 224051;2.江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇 鎮江 212013;3.鹽城市雨露農業科技有限公司,江蘇 鹽城 224000)

金針菇(Flammulinavelutipes)又名冬菇、樸菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌,隸屬于擔子菌亞門,層菌綱,傘菌目,口蘑科,金錢菌屬[1]。金針菇形美、味鮮,營養豐富,具有較高的觀賞價值及食用和藥用價值,是世界上著名的食藥兩用菌和觀賞菌[2]。金針菇富含蛋白質、維生素B1、維生素B2、維生素C、核苷類、纖維素及多種微量元素等營養成分[3],并且金針菇脂肪含量低,是一種高鉀低鈉的食品;另有研究發現,金針菇中含有18種氨基酸,每100 g干菇中含氨基酸總量20.98 g,其中人體所必需的8種氨基酸占總量的44.5%,特別是賴氨酸和精氨酸的含量非常高,這些指標都高于其他食用菇類,故對兒童的智力發育和健康成長有益,因而有“益智菇”之稱[4-6]。金針菇纖維素具有降低膽固醇的作用,同時還能預防和治療肝臟系統及腸胃道潰瘍[7];金針菇多糖則是一種良好的免疫增強劑,能增強T細胞功能,激活淋巴細胞及吞噬細胞,促進抗體產生,誘導干擾素的形成,通過恢復和提高機體的免疫功能來抑制腫瘤的生長[8-12]。

液態發酵有培養周期短、菌齡整齊、發酵快、成本低等優點,具有很大的發展前途[13-14]。由于金針菇的子實體生長周期長,且乃能在比較低的溫度條件下出菇,受季節影響大,因此采用液體發酵技術工廠化生產金針菇菌絲體,以替代子實體在食品、醫藥方面的應用就成為一個比較新的研究方向。

本研究對金針菇液體種子發酵培養基的組分進行了篩選及優化,通過測量pH值、還原糖、氨基酸態氮、蛋白酶活力、纖維素酶活力、淀粉酶活力、菌絲球個數和菌絲干質量這些指標,來評價菌種對各種營養素的吸收情況和生長情況,進而評價培養基對金針菇液體菌種生物量的影響,確定最適培養基配方,為高質量的工業化大生產提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇(Flammulina velutipes)菌種:鹽城市雨露農業科技有限公司提供。

葡萄糖、可溶性淀粉:上海中試化工總公司;蔗糖、氯化鉀:天津市科密歐化學試劑有限公司;黃豆粉、硫酸銨:天津市福晨化學試劑廠;蛋白胨、磷酸二氫鉀:上海化學試劑有限公司;磷酸氫二鉀:廣東汕頭市西隴化工廠;維生素B1、維生素B2、維生素B6:上海士峰生物科技有限公司;瓊脂粉、3,5-二硝基水楊酸:國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

BS-2F振蕩培養箱:金壇市杰瑞爾電器有限公司;FA1104電子天平:上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SW-CJ-1D無菌操作臺:江蘇通澤器械有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R):上海博訊實業有限公司;DNP電熱恒溫培養箱:上海金宏實驗設備有限公司;UV752N紫外可見分光光度計:上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂[14](potato dextrose agar,PDA)斜面培養基放入28℃恒溫培養箱觀察2 d,沒有雜菌則可以進行接種;將金針菇菌種接種到接入馬鈴薯葡萄糖液態種子培養基中,在28℃、120r/min條件下搖床培養5d進行活化培養。

通過無菌操作技術,取1 mL金針菇的液體菌種接入裝有液體發酵培養基(可溶性淀粉2%,黃豆粉3%,KH2PO40.1%,VB20.01%,蒸餾水800 mL,pH自然)的錐形瓶中,每種同樣條件下做3個平行試驗,置于28℃、150 r/min條件下搖床振蕩培養箱中搖床培養8 d。

1.3.2 指標測定方法

參考ZENGX L等[15]的方法并加以改進,測定金針菇的菌絲體生物量;參考趙斌等[16]方法對發酵培養液中的菌絲球計數;用pH計測定發酵液pH值[17];3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法測定培養液還原糖含量;參考焦巧芳[18]的方法測定淀粉酶活力和纖維素酶活力;紫外分光光度法測定蛋白酶活力[19];甲醛滴定法測定氨基酸含量[20];革蘭氏染色法制進行鏡檢,檢查培養液是否污染,確保試驗的正常進行。

1.3.3 最佳發酵培養基組分篩選試驗

搖瓶發酵培養基的碳源分別設置為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉,氮源分別設置為黃豆粉、蛋白胨、硫酸銨,無機鹽分別設置為KCl、KH2PO4、K2HPO4,維生素分別設置為VB1、VB2、VB6。每種碳源、氮源、無機鹽和維生素3次重復,在250 mL三角瓶中裝入100 mL培養基。

1.3.4 發酵培養基優化正交試驗

通過碳、氮源、無機鹽和維生素篩選試驗,選取4個最佳因素,并同時進行各因素添加量優化試驗,選出最佳添加量,各取其附近的3個添加水平進行L9(34)正交試驗,確定碳源、氮源、無機鹽及維生素的最適配比。正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 發酵培養基配方優化正交試驗設計因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization

2 結果與分析

2.1 發酵培養基配方優化試驗

2.1.1 碳源種類優化結果

碳源是微生物生長代謝的主要營養物質,其主要為細胞提供碳架,提供細胞生命活動所需的能量[21]。保持發酵培養基的其他組成不變(黃豆粉3%,KH2PO40.1%,VB20.01%),分別加入3種不同碳源:葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉,添加量均為2%,每種碳源做3個平行,各組結果取平均值,試驗結果如表2所不。

表2 不同碳源對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table2 Effect of different carbon source on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表2可知,這3種碳源對金針菇菌絲體生長及酶活的影響由大到小的順序是可溶性淀粉＞葡萄糖＞蔗糖。因為金針菇菌種在發酵過程中會產生一些酶類能更加有效分解營養物質,其中淀粉酶和纖維素酶可以水解碳源生成還原糖,故發酵液中還原糖含量與這2種酶活力的高低可間接反映菌種對碳源的利用率;但在培養后期部分菌絲體蛋白質分解產生氨基酸態氮類物質及菌絲球老化自溶釋放出氨基酸態氮物質,其氨基酸態氮含量逐漸增加,蛋白酶活力在一定程度上反映了菌種的穩定性;又因氨基酸態氮是堿性物質,故發酵液的pH隨之變化。試驗數據顯不以可溶性淀粉為碳源的培養基的發酵液中還原糖含量最高,達到1.82 g/100 mL,其淀粉酶活力和纖維素酶活力同時也較另2種碳源高;測得的氨基酸態氮含量最低,僅為9.81g/100mL,pH最低,說明菌種在該培養基中較為穩定生長;而最直觀的數據則是該培養基的菌絲干質量是其他兩種碳源培養基的1.5倍左右,而菌絲球數甚至高達其他碳源培養基的1.8倍和2.8倍;同時可溶性淀粉又具有價格相對低廉的優勢[22],因而綜和選擇可溶性淀粉為金針菇發酵培養的最適碳源。

2.1.2 碳源添加量的優化結果

在確定培養基中最適碳源種類是可溶性淀粉的基礎上,將添加量分別調整為1%、2%、3%、4%。分別進行發酵培養,培養基的其他組成同上2.1.1,每種水平做3個平行,取平均值,根據指標測定結果確定最適碳源的水平,試驗結果如表3所不。

表3 不同可溶性淀粉添加量對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table3 Effect of different soluble starch addition on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表3可知,以可溶性淀粉為碳源,不同添加量的可溶性淀粉對菌絲生長及酶活有明顯影響。可溶性淀粉添加量低于3%,菌絲體生物量隨著添加量增加而增加,當碳源添加量為3%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖最高,氨基酸態氮最低。此后,菌絲干質量、酶活以及還原糖、氨基酸態氮隨碳源添加量的升高呈降低趨勢。這可能是由于碳源含量過高,引起菌體異常繁殖,對菌體的代謝、能量傳遞產生了影響[23]。因此確定可溶性淀粉最佳添加量為3%。

2.1.3 氮源種類優化結果

氮源主要是用于合成菌體細胞物質(如核酸、蛋白質、氨基酸)以及合成一些含氮代謝產物,在食用真菌液態發酵中起重要作用[24]。而有機氮源不僅富含蛋白質、氨基酸以及一些糖類、無機鹽等微生物生長所需營養物質外,還能提供某些次級代謝產物的前體物質[25]。保持發酵培養基的其他組成不變(可溶性淀粉3%,KH2PO40.1%,VB20.01%),分別加入3種不同氮源:有機氮源蛋白胨、黃豆粉和無機氮源硫酸銨,添加量為3%。每種氮源做3個平行,各結果取平均值,結果如表4所不。

表4 不同氮源對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table4 Effect of different nitrogen source on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表4可知,3種氮源對參數的影響可以通過菌絲干質量和菌絲球數直觀地發現,菌種在無機氮源硫酸銨的培養基中生長狀況不佳,但在添加有機氮源蛋白胨、黃豆粉的培養基中生長良好,以黃豆粉作為氮源的培養基的效果最好:菌球數大約是另2種培養基的1.5倍,菌絲干質量達到0.59 g/100 mL,其蛋白酶活力最高,為1.13 U/mL,氨基酸態氮量最低,故其pH偏酸性;纖維素酶活和淀粉酶活也高于其他2種氮源,原因可能是菌種對氮源利用也在一定程度上促進了對碳源的利用[26]。因此選用黃豆粉作為最佳氮源。

2.1.4 氮源添加量的優化結果

在確定培養基中最適氮源是黃豆粉的基礎上,將添加量分別調整為2%、3%、4%、5%。分別進行發酵培養,培養基的其他組成同上2.1.3,每種水平做3個平行,取平均值,根據結果確定最適添加量,結果如表5所不。

由表5可知,黃豆粉添加量由2%增加至4%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖逐漸增加,氨基酸態氮逐漸降低。當添加量達到4%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖達到最高,其中菌絲干質量達到0.61g/100mL。而當添加量繼續升高時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖呈降低趨勢。因此確定黃豆粉的最適添加量為4%。

表5 不同黃豆粉添加量對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table5 Effect of different soybean meal addition on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

2.1.5 無機鹽種類優化結果

無機鹽是構成菌體的成分,具有調節細胞滲透壓、酸堿平衡和維持細胞的形態和功能的作用[24]。保持發酵培養基的其他組成不變(可溶性淀粉3%,黃豆粉4%,VB20.01%),分別加入3種不同無機鹽:KCl、KH2PO4、K2HPO4,添加量為0.1%。3種無機鹽各做3個平行,取平均值,試驗數據如表6所不。

表6 不同無機鹽對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table6 Effect of different inorganic salt on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表6可知,這3種無機鹽對金針菇菌絲體生長及酶活的影響順序是:KH2PO4＞K2HPO4＞KCl,但相互之間的差異并不明顯,比如以KH2PO4為無機鹽的培養基中菌球數僅比K2HPO4的菌球數多10個/100 mL;菌絲干質量僅僅多重0.02 g/100 mL;3種酶活力也相差不大,但其中以KH2PO4為無機鹽的培養基酶活最高,還原糖量最多,氨基酸態氮最低,故選擇KH2PO4為最適無機鹽。

2.1.6 無機鹽添加量的優化結果

在確定培養基中最適無機鹽是KH2PO4的基礎上,將添加量分別調整為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%。分別進行發酵培養,培養基的其他組成同上2.1.5,每種水平做3個平行,取平均值,試驗結果如表7所不。

表7 不同KH2PO4添加量對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table7 Effect of different KH 2PO4 addition on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表7所不,KH2PO4添加量由0.05%增加至0.10%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖逐漸增加,氨基酸態氮逐漸降低;當添加量達到0.10%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖達到最高,其中菌絲干質量達到0.62 g/100 mL。而當添加量繼續升高時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖呈降低趨勢。因此確定KH2PO4的最適添加量為0.10%。

2.1.7 維生素種類優化結果

保持發酵培養基的其他組成不變(可溶性淀粉3%,黃豆粉4%,KH2PO40.1%),分別加入3種不同維生素:VB1、VB2、VB6,添加量選為0.01%。每種各做3個平行,取平均值,結果如表8所不。

表8 不同維生素對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table8 Effect of different vitamins on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表8可見,這3種維生素對金針菇菌絲體生長及酶活的影響順序是:VB2＞VB1＞VB6,以VB2為維生素的培養基的菌球數最高,為640個/100mL;菌絲干質量為0.64g/100mL;且3種酶活也高于另2種維生素,還原糖量最多,氨基酸態氮最低,故VB2為最適維生素。

2.1.8 維生素添加量的優化結果

在確定培養基中最適維生素是VB2的基礎之上,將添加量分別調整為0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%。分別進行發酵培養,培養基的其他組成同上2.1.7,每種水平做3個平行,取平均值,試驗結果如表9所不。

表9 不同維生素B2添加量對金針菇菌絲生長及酶活的影響Table9 Effect of different vitamin B2 addition on growth and enzyme activity of mycelium of Flammulina velutipes

由表9所不,VB2添加量由0.005 0%增加至0.007 5%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖逐漸增加,氨基酸態氮逐漸降低。當添加量達到0.007 5%時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖達到最高,其中菌絲干質量高達0.67 g/100 mL。而當添加量繼續升高時,菌絲干質量和菌球數以及酶活力、還原糖呈降低趨勢。因此,確定VB2的最適添加量為0.007 5%。

2.2 正交試驗結果

以上述培養基優化試驗結果為基礎,參考郭欣欣等[27]的試驗方法并加以改進,以可溶性淀粉(A)、黃豆粉(B)、KH2PO4(C)以及VB2(D)添加量為評價因素,以菌絲干質量為評價指標進行L9(34)搖瓶發酵試驗,正交試驗結果與分析見表10與表11,方差分析見表12。

表10 發酵培養基配方優化正交試驗結果與分析Table10 Result and analysis of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization

表11 以多因素為評價指標的正交試驗結果Table11 Results of orthogonal experiments using multi-factors as evaluation indexes

表12 以菌絲體干質量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table12 Variance analysis of orthogonal experiments results based on dry mass of mycelium as evaluation index

研究改變培養基配方,檢測不同組合對金針菇菌種的生長及發酵液中部分指標,最終目標是為了獲得更好的金針菇菌種,故最終以菌絲干質量作為評價指標對其進行直觀分析。由表10極差分析結果可知,培養基的不同組分對金針菇菌絲生長及酶活的影響由大到小順序依次為B＞A＞D＞C,即改變氮源水平對菌絲生長影響最大。以K值最佳選擇最優組合為A2B3C1D1,即黃豆粉5%、可溶性淀粉3%、KH2PO40.05%、VB20.005 0%;而由表12可知,黃豆粉對金針菇液體發酵菌絲產量有顯著影響(P＜0.05),而可溶性淀粉、KH2PO4和VB2對液體發酵菌絲產量影響并不顯著(P＞0.05)。

在最佳條件下進行驗證試驗,測得各項指標如下:菌球數743個/100 mL,菌絲干質量0.71 g/100 mL;淀粉酶活、纖維素酶活以及還原糖量分別為1.84 U/mL、1.25 U/mL和2.01 g/100 mL;蛋白酶活為1.28 U/mL,氨基酸態氮量低,為10.49 g/100 mL,pH略偏酸性,為6.86。該驗證試驗說明金針菇菌種在最優組合培養基中生長良好。

3 結論

由金針菇液態發酵培養基的優化試驗,得出最適碳源、氮源、無機鹽與維生素;而深入探究培養基各因素對金針菇的菌絲體生物量的影響大小,發現氮源的影響最大,其次是碳源,氮源中黃豆粉的影響最為顯著;同時也確定了金針菇的最佳液體培養基配方為:黃豆粉5%、可溶性淀粉3%、KH2PO40.05%、VB20.005 0%,并進行了驗證試驗,結果表明,金針菇在此培養基配比下,菌絲體生物量達到了0.71 g/100 mL。研究結果為金針菇的液態培養提供了一定的理論基礎和技術支持。