產單寧酶海洋短梗霉的分離篩選及酶學性質的研究

趙春海

(濱州職業學院,山東 濱州 256603)

單寧屬于天然多酚類物質,廣泛存在于植物的莖葉和果實中。單寧是食物和飼料中澀味的主要來源。單寧包含多個酚羥基,能與蛋白質的亞胺基交聯成鍵,形成疏水性沉淀。飼料中單寧與口腔黏膜、唾液以及消化道中的蛋白質結合,高濃度的單寧不利于飼料中營養價值的吸收和利用,單寧也能與金屬元素結合,從而降低對礦物元素利用,食物和飼料中都必須控制單寧的濃度,高濃度單寧必須降解去除[1-4]。

降解單寧的主要有3種方法:物理法(高溫處理)、化學法(有機溶劑)和生物酶法。其中物理方法耗能高,且乃能消除70%的單寧。化學法主要添加有機溶劑來降低單寧含量,安全性低且容易造成環境污染[5-7]。利用酶法降低單寧含量操作簡單,并且節能環保,在生產生活中具有重要價值[8-10]。

單寧酶(EC 3.1.1.20)能水解單寧物質中的酯鍵,生成沒食子酸、葡萄糖及其他醇類化合物。單寧酶是美國食品與藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準應用的安全食品,我國已將其列入食品添加劑名錄。在單寧酶的基礎研究及工業應用方面,美國、日本研究得較早。國內對單寧酶的研究較晚,隨著市場需求量的不斷增加,急需從菌種、生產工藝進行突破,因此,開展微生物發酵生產單寧酶的工藝研究,提高酶活性、穩定性,相對降低酶的價格,對于擴大單寧酶的生產規模,助推國內單寧酶的工業生產具有重要意義[11-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

自行分離,來源于東海、南海、渤海灣的海水、海泥、動植物體表與動物腸道。

1.1.2 培養基

菌種分離培養基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,海水1 L,氯霉素0.1 g/L,pH自然,瓊脂20 g/L,115℃滅菌30 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液體培養基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,115℃滅菌30 min。

產酶篩選培養基:單寧20 g/L,硝酸銨10 g/L,瓊脂30 g/L,溴酚藍0.002 g/L,115℃滅菌30 min。

產酶發酵培養基:單寧酸10 g/L,硝酸銨20 g/L,葡萄糖20 g/L,pH 5.0,115℃滅菌30 min。

糖發酵測試培養基:葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、木糖制備形成100 g/L的糖母液。將上述糖母液分別裝入小試管中,并加入酵母粉,最終控制糖質量濃度為20 g/L,酵母粉質量濃度為10 g/L,每個發酵糖做3個平行,發酵糖試管中加入一個杜氏小管,115℃滅菌30 min。

同化碳源培養基:(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,酵母膏0.2 g/L,瓊脂20 g/L,115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

0.05 mol/L甲醇羅丹寧溶液,0.01 mol/L沒食子酸丙酯,0.5 mol/L KOH溶液,0.1 mol/L檸檬蘇-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2 儀器與設備

SPX-180生化培養箱:上海丙林電子科技有限公司;Microfuge1-16K離心機:德國Sigma公司;PHSJ-3FpH數字式酸度計:上海儀電科學儀器股份有限公司;OlimpusCX23顯微鏡:上海賴氏電子科技有限公司;UV-2102 C型紫外分光光度計:上海圣科儀器設備有限公司;5334聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction,PCR)儀:德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 產酶菌種的初篩

采集樣品預處理后,制備菌懸液涂布產酶篩選固體培養基上,28℃培養2 d,觀察微生物生長情況,選擇單菌落點轉接在產酶篩選固體培養基上,再培養3 d,觀察形成水解圈的情況。通過測量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d),以D/d值作為初篩依據,篩選產酶能力較高的菌株。

1.3.2 單寧酶活力測定

產酶能力較高的菌株在發酵培養基中培養,發酵液16 000 r/min離心10 min得到粗酶液。比色管中分別加入0.5mL沒食子酸丙酯溶液,以0.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液為空白對照,測試管加入0.5mL粗酶液,酶解條件為30℃處理5 min,在酶解和對照管中分別加入1.0 mL 0.05 mol/L羅丹寧溶液,30℃處理5 min。在酶解和對照管中加入0.5 mol/L KOH溶液0.5 mL,30℃處理5 min。反應結束后將5 mL蒸餾水分別加入酶解管和對照管中,30℃處理5 min。充分混勻后在波長520nm處測定吸光度值,單寧酶活力根據吸光度值的變化來計算[16-20]。

酶活定義:在pH5.5、30℃的條件下,每分鐘產生1μmol/L沒食子酸所需要的酶量作為1個酶活單位(U)。

1.3.3 菌種的生理生化鑒定

分別進行糖發酵測試與碳源同化測試。

1.3.4 分子生物學鑒定

(1)對分離的產酶菌株進行基因組提取,在生理生化基礎上進行分子生物學鑒定。根據分離菌株的ITS測序結果,與GenBank數據庫中保存的已知標準菌株進行同源比對,根據與已知菌株同源序列比對結果通過軟件構建ITS系統發育進化樹。

(2)海洋菌株95 ITS序列的PCR擴增[8-9]:

ITS序列擴增的引物為:正向引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';反向引物5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',采用該引物進行PCR體外擴增,目標產物大約為550 bp。

(3)菌株產酶曲線的測定

產酶菌株在YPD液體培養基中過夜培養作為種子液,以5%的量接入產酶培養基在28℃、160r/min條件下振蕩培養96 h,每隔12 h取發酵液16 000 r/min離心10 min,做3個平行樣,測定發酵單寧酶活性,并繪制菌株產酶曲線。

1.3.5 粗酶液酶學性質的研究

產酶菌株接種于液體培養基中,培養12 h作為種子液,以5%的量接入產酶培養基在28℃、160 r/min條件下振蕩培養72 h,取發酵液離心獲得粗酶液。

(1)溫度對胞外單寧酶酶促反應的影響[22]

粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下進行酶促反應,保持pH=5條件下,分別測定不同溫度下酶活性,每個條件測定3次,計算相對酶活。

(2)胞外單寧酶粗酶液的熱穩定性[23]

粗酶液穩定性試驗,將樣品分別在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下放置4h,迅速冷卻后,然后在30℃、pH=5.5條件下測定酶活力,計算相對酶活。

(3)pH對酶促反應的影響

以pH=3、4、5、6、7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制反應底物,加入粗酶液在30℃下進行反應,測定酶活力,計算相對酶活。

(4)胞外單寧酶粗酶的pH穩定性

粗酶加到pH=3、4、5、6、7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在4℃條件下放置4 h,在30℃、pH=5.5條件下測定酶活力,計算相對酶活。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

將分離樣品在YPD液體培養基中培養,取50mL菌液點在篩選培養基上,30℃培養48 h,結果如圖1所不,透明圈與菌落直徑比(D/d值)見表1。結果表明,不同菌種在平板上的生長情況差異明顯,81號菌落周圍透明圈很小,82號菌生長緩慢,未形成明顯透明圈。86號菌落周圍出現了明顯的透明圈,其半徑小。75號菌落接種量較大,菌落變形,菌落周圍呈現出清晰的透明圈。95號菌落生長較好,透明圈清晰且較大。參照D/d值,選擇95號菌作為研究對象,進行產酶研究。

圖1 不同菌株菌落平板水解結果Fig.1 Results of colony plate hydrolysis of different strains

表1 不同菌株透明圈與菌落直徑的比Table1 Ratio of transparent circle to colony diameter of different strains

2.2 菌株的菌落和細胞形態

將菌株95號接種至固體YPD平板上,在28℃培養48 h,觀察平板上的菌落,通過顯微鏡觀察細胞形態,結果見圖2。從圖2-A可以看出,菌株95號菌落呈星狀,酵母菌常有的乳白色,菌落邊緣不規則,較濕潤,菌落與營養機制結合緊密;從圖2-B可以看出,顯微鏡下直接觀察菌株75號細胞形橢圓形,單個分散,有明顯的芽殖體。

圖2 菌株95號的菌落形態(A)和細胞形態(B)Fig.2 Colony morphology(A)and cell microscopy(B)of strain 95#

根據酵母菌鑒定方法,糖發酵和碳源同化試驗是菌株鑒定的兩個重要試驗,分離菌株95號的糖發酵試驗情況見表2,碳源同化情況見表3。

表2 菌株95號的碳源發酵結果Table2 Carbon fermentation results of strain 95#

表3 菌株95號的碳源同化結果Table3 Carbon assimilation results of strain 95#

由表2和表3可知,菌株95號能夠同化多種糖類,但不能夠同化乳糖。根據同化與發酵結果,并與酵母鑒定手冊的標準數據進行比較,測試菌株95號與Aureobasidium subglaciale標準菌株的碳源發酵和同化結果一致。

2.3 分子鑒定

ITS序列進行比對的結果均表明,單寧酶菌株95與Aureobasidium subglaciale的序列最為接近,數據結果相似性高達99%以上,以標準菌株為標準進行進化樹繪制,結果見圖3。

圖3 菌株95號的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 95＃

由圖3可知,單寧酶菌株95與Aureobasidiumsubglaciale聚類到同一支,分子生物學中ITS鑒定與生理生化鑒定結果一致,最終將分離獲得海洋單寧酶菌株95號確定為Aureobasidiumsubglaciale。目前曲霉屬是報道中最主要的生產單寧酶菌種[2,10,12,13,16,22],Aureobasidium subglaciale未曾有報道,此外KUMARM等[9-10]從克雷白氏桿菌(Klebsiella),分離獲得了目前來源于細菌的最小分子質量的嗜熱單寧酶,最優催化溫度為50℃,極小阿托波氏菌也被報道可以進行單寧酶的生產[18]。

2.4 菌株95號產酶曲線的測定

菌株95號產酶菌株在YPD液體培養基中過夜培養作為種子液,以5%的量接入產酶培養基在28℃、160 r/min條件下振蕩培養,其發酵產酶曲線見圖4。由圖4可知,菌株95號在發酵前24 h產酶很低,從24 h開始驟然升高,也與菌體密度保持一致,發酵72 h在胞外達到最大活力323.2 U/mL。已報道[8,10,12,17,20]的產單寧酶菌株酶活普遍低于300 U/mL,菌株95號活力較高,且產酶周期類似,說明菌株95號是較好的產酶菌株。

圖4 菌株95號發酵產酶曲線Fig.4 The enzyme production curve of strain 95＃fermentation

2.5 酶學性質

2.5.1 溫度對胞外單寧酶酶促反應的影響

粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下進行酶促反應4 h,保持pH=5測定酶活力,每個試驗做3個平行樣,以50℃下的活力為100%,計算各樣品相對酶活力,結果見圖5。

圖5 溫度對胞外單寧酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity of extracellular tannase

由圖5可知,該酶最適反應溫度為60℃,在40～70℃之間能保持較高的酶促反應速率。當反應溫度升高且低于50℃時,酶促反應的底物能量增加同時活化的分子數增多,提高了分子間的碰撞概率,使得同等條件下酶促反應速度加快;而酶蛋白在過高的溫度下結構會發生變化,逐漸變性,活性降低。根據文獻報道[21-22],多數單寧酶在0～45℃之間保持較高的酶活性。可見菌株95號所產的單寧酶保持活力的溫度范圍更寬,有較強的應用潛力[4,6,7,10]。

2.5.2 胞外單寧酶的熱穩定性

以常見低溫保藏酶溫度4℃開始、選擇30℃、40℃、50℃、60℃、70℃分別保存粗酶液4 h,流水迅速冷卻后,然后在30℃、pH=6條件下測定酶活力,以初始活力為100%,計算各樣品的相對酶活力,結果如圖6。由圖6可知,在30℃、40℃、50℃水浴保溫4 h,相對酶活力為80%以上,從60℃開始活力下降明顯。此外該單寧酶在30～60℃條件下保溫4 h活力無明顯下降,70℃溫度較高,酶已經失活。已報道[23-24]的多數單寧酶在60℃保溫1 h,酶活力幾乎完全喪失,本研究得到的胞外單寧酶熱穩定性高于現有絕大多數單寧酶,可滿足食品加工工藝中處理時間的要求。

圖6 溫度對胞外單寧酶酶的熱穩定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the thermal stability of extracellular tannase

2.5.3 pH對酶促反應的影響

以pH=3、4、5、6、7、8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制反應底物,加入粗酶在30℃條件下進行反應,以pH 6條件下的活力為100%,計算各樣品相對酶活力,結果見圖7。如圖7所不,胞外單寧酶最適反應pH為6,pH在3～7之間均有較高反應速率。這與文獻報道[18,20,22]的大部分單寧酶酶促反應最適pH在4.5～6.0之間相符。

圖7 pH值對酶促反應的影響Fig.7 Effect of pH value on enzymatic reaction

2.5.4胞外單寧酶的pH穩定性

粗酶加到檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=3、4、5、6、7)在4℃條件下放置4 h,在30℃、pH=6條件下,以初始活力為100%,計算各樣品的相對酶活力結果見圖8。該單寧酶具有較廣的pH值穩定性,在pH值4～7之間相對酶活為60%以上。文獻報道單寧酶多為酸性蛋白,其性質可能與此相關。

圖8 胞外單寧酶酶的p H值穩定性Fig.8 Stability of pH value of extracellular tannase

3 結論

本研究從海洋微生物中篩選到高產單寧酶的菌株95號,綜合生理生化和分子生物學鑒定結果,該菌株鑒定為Aureobasidium subglaciale,其在發酵培養基中培養72 h達到最大活力323.2 U/mL,與其他產單寧酶微生物相比達到了較高的產酶水平。該菌株所產單寧酶最適反應溫度為50℃,該酶在30℃、40℃、50℃水浴保溫4 h,相對酶活80%以上,具有較好的熱穩定性;單寧酶最適反應pH和最穩定pH均為6,同時酶具有較廣的pH值穩定性。本研究中的單寧酶保持活力的條件較為廣泛,與茶葉加工、果汁制作的工藝條件接近,所以此單寧酶在去除茶葉冷后渾濁、果汁飲料除澀方面有較好的應用優勢。Aureobasidiumsubglaciale單寧酶的發酵研究,拓寬了單寧酶種植資源,同時本研究中的單寧酶具有良好的熱穩定性和pH穩定性,有較大的應用潛力。