HS-SPME-GC-MS測定食醋中羥甲基糠醛衍生物的研究

王 鑫,李丹丹,李 婷,陳 峰,2,3,肖安風,2,3,倪 輝,2,3*

(1.集美大學 食品與生物工程學院,福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門 361021;3.廈門市食品生物工程技術研究中心,福建 廈門 361021)

羥甲基糠醛(hydroxymethyl furfural,HMF)是食品中常見的成分[1-2],已經有一些學者對羥甲基糠醛衍生物進行了研究,5-甲基糠醛是一種允許使用的食品添加劑[3],糠醛在我國是一種允許使用的食品用合成香料[4],但過量使用存在安全隱患,大鼠經口半數致死量為65 mg/kg;此外,糠醛還具有強烈的刺激性和麻醉作用,吸入后可能出現刺激呼吸道等生理反應[5]。一定劑量的糠醛被機體吸收后,會對肝臟、腎臟、心臟等器官產生不良影響[6]。

食醋是一種人們常用、滋味豐富的酸性調味品。根據發酵方式不同,食醋可分為固態發酵食醋和液態發酵食醋[1]。食醋中含有一定量的5-羥甲基糠醛[2,7]。近年來,周婷婷等[8]通過高效液相色譜(high performanceliquid chromatography,HPLC)法測定老陳醋中羥甲基糠醛的含量。閻玉林[9]通過固相微萃取串聯氣質聯用法(solid-phasemicroextraction/gas chromatography-massspectrometer,SPME/GC-MS)從食醋中鑒定出糠醛和5-甲基糠醛等成分。周鈺欣等[10]通過GC-MS從岐山醋、北京米醋、鎮江陳醋、山西陳醋和海天陳醋五種固態發酵食醋中鑒定出糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇等成分。但是目前對食醋中羥甲基糠醛衍生物的研究相對還較少,還不清楚各類食醋中羥甲基糠醛衍生物的含量差異及其對消費者健康的影響。

目前,國內外測定羥甲基糠醛類物質的方法主要有分光光度法[11]、紫外光譜法[12]、高效液相色譜法[13]、氣相色譜-質譜法[14]和液相色譜-串聯質譜法[15]等;其中最常用的方法是氣相色譜-質譜聯用方法。因此,本實驗利用SPME/GC-MS測定食醋中羥甲基糠醛衍生物,并開展方法驗證實驗,用其分析常見食醋中羥甲基糠醛衍生物的含量,為分析各類食醋中羥甲基糠醛衍生物的含量差異提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

環己酮(純度≥99.5%)、正己烷(純度≥99%)、糠醛(純度≥99%)、5-甲基糠醛(純度≥99%)、2-乙基-1-己醇(純度≥99%):美國Sigma-Aldrich公司;羥甲基糠醛(≥99%):南京愛里凱德化工有限公司;鹽酸、乙酸、乳酸、無水乙醇、氫氧化鈉(均為分析純):國藥集團上海化學試劑有限公司。

永春香醋、永春老醋、海堤香醋、恒順香醋、紫林山西陳醋:均購于廈門本地商場。

1.2 儀器與設備

QP-2010 Plus氣相色譜質譜串聯儀和Rtx-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm)色譜柱:日本島津公司;手動SPME進樣器、75μm DVB/CAR/PDMS萃取頭:美國Supelco公司;SHZ-IIID循環水真空泵:上海亞榮生化儀器廠;ZXRD-B5210鼓風干燥箱:上海智誠分析儀器公司;HH-1數顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取5 mL樣品溶液置于50mL萃取瓶中,加1μg/mL的環己酮10μL作為內標,再加入25 mL水,然后置于60℃水浴中平衡5 min后,將已老化的萃取頭插入裝有樣品的萃取瓶中,吸附20 min。然后將萃取頭插入氣相色譜進樣口中解吸3 min,進行GC-MS分析(重復3次)。

1.3.2 氣相色譜質譜聯用儀的分析操作條件

氣相色譜條件:色譜柱為Rtx-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm),載氣為高純氦氣(He)(純度99.999%),柱流量為3 mL/min,分流比為1∶5。升溫程序:程序升溫,進樣口溫度為250℃,初始溫度在40℃保持1min,然后以5℃/min升溫至220℃保持1.5min。

質譜條件:離子源溫度為250℃,電離方式為電子電離(electron ionization,EI),電離能量為0.85 kV,質譜接口部分溫度為250℃,SCAN模式掃描,離子碎片掃描范圍在33～450 m/z之間。

1.3.3 羥甲基糠醛衍生物的鑒定

對揮發性成分共采用了三種方式進行定性:

(1)利用質譜數據庫(NIST08、NIST08s、FFNSC1.3)進行相似度檢索、特征峰分析;

(2)通過正構烷烴計算保留指數并參考有關文獻報道的保留指數進行綜合定性[16-17];

(3)與標準品的特征離子碎片和參考保留指數進行比較定性[18-20]。

1.3.4 標準線性曲線建立

定量方法采用加內標校正的外標法進行定量,內標為0.33μg/mL的環己酮溶液。根據1.3.2中給出的色譜條件、升溫程序和質譜條件,在質譜選擇性離子監測(selected ion monitoring,SIM)模式下進行分析。以糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇含量為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL對糠醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇和環己酮峰面積比繪制標準工作曲線。

1.3.5 方法檢測限和定量限

把最低濃度的混合標準品溶液再向下稀釋,得到一系列更低濃度的混合標準品溶液,直到信噪比≥3時的標準品濃度,即為檢測限[21],而信噪比≥10時的標準品濃度是定量限[22]。取5 mL空白樣品,添加1μL混合標準溶液(5-甲基糠醛、糠醛和2-乙基-1-己醇混合標準品溶液,10μg/mL)和10μL內標(環己酮溶液,1μg/mL),逐倍稀釋至信噪比≥10和信噪比≥3。

1.3.6 方法回收率

由于乙酸在食醋中含量較高,在萃取頭上會發生競爭吸附現象,抑制其他組分的吸附,因此,需要將食醋樣品中和至pH=7后再進行回收率實驗[23]。分別向中和后的永春老醋中添加混合標準品溶液25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL,然后把加標后的樣品按照與樣品相同的處理方法處理后上機測定,每個濃度平行測定3次,以食醋初始濃度為空白計算測定得到的羥甲基糠醛衍生物含量,計算回收率,其計算公式如下:

1.3.7 方法準確度和精密度

通過日內和日間變化來評價定量方法的準確度和精密度,從而反映樣品的穩定性[24]。日內變化是同一天測定同一個一定濃度的混合標準品溶液3次,計算含量和誤差。日間變化是連續3天測定同一個混合標準品溶液,每天測定一次,計算含量和誤差。試樣平均測量值和理論含量的比值關系反映準確度,計算相對標準偏差,反應精密度。

1.3.8 實際樣品的測定

揮發性成分通過相應的標準曲線進行濃度定量。由于山西紫林陳醋和恒順香醋中部分成分超過標準曲線線性范圍,所以先將其稀釋20倍后測定。

1.3.9 數據處理

參照相關文獻,利用通過Excle 2013(微軟,美國)和SPSS 19.0(IBM,美國)軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 食醋樣品中羥甲基糠醛衍生物的鑒定及標準曲線制定

五種食醋樣品中的揮發性成分經過GC-MS分析,得到食醋樣品中揮發性成分的總離子流色譜圖,如圖1所不。通過數據庫信息檢索、計算保留指數與標準品保留指數及參考文獻對比,鑒定出糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇共3種羥甲基糠醛衍生物,其鑒定結果及標準曲線如圖1和表1所不。方法檢測限和定量限結果見表1,糠醛的檢測限為3.33×10-2μg/L,5-甲基糠醛的檢測限為3.33×10-1μg/L,2-乙基-1-己醇的檢測限為4.17×10-6μg/L;定量檢測限在6.67×10-1-3.33 μg/L之間。ZHU H等[25]建立HS-SPME/GC-MS分析方法檢測山西老陳醋中的揮發性成分,發現糠醛、5-甲基糠醛檢測限分別為0.352μg/L和1.174μg/L;定量限分別為0.150μg/L和0.500μg/L。本方法的檢測限和定量檢測限與相關文獻報道的值相似。

圖1 處理過的五種食醋樣品中揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in the five treated vinegar samples analysis by GC-MS

表1 羥甲基糠醛衍生物的標準曲線、檢測限和定量限Table1 Standard curve,limit of detection and limit of quantitation of hydroxymethylfurfural derivatives

2.2 方法回收率

食醋中羥甲基糠醛衍生物的回收率結果見表2。由表2所不,在食醋中,糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇的平均回收率范圍是81.62%～96.47%,表不方法準確度良好,本方法的加標回收率值與相關文獻報道的值相似[26]。

表2 食醋中羥甲基糠醛衍生物的回收率Table2 Recovery rate of hydroxymethylfurfural derivatives in vinegar

2.3 方法準確度和精密度

準確度和精密度測定結果見表3,食醋中檢測到的3種羥甲基糠醛衍生物的測定日內準確度在88.50%～94.05%,日間準確度在84.09%～93.17%,日內精密度相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)≤4.36%,日間精密度RSD≤8.02%,林曉珊等[27]利用GC-MS測定調味品中的3種糠醛類物質,日內精密度RSD均＜5%,說明方法的準確度和精密度可靠,符合檢測要求。

表3 方法準確度和精密度Table3 Accuracy and precision of the analysis method

2.4 實際樣品的測定

運用SPME/GC-MS分析方法,對市售的幾種不同來源的食醋等樣品進行測定,結果見表4。利用該方法測得市售的五種食醋中,糠醛在恒順香醋中含量最高,為7077.31μg/L,在永春老醋中含量最低,為179.23μg/L;5-甲基糠醛在紫林山西陳醋中含量最高,為684.27μg/L,在永春香醋中含量最低,為260.47μg/L;2-乙基-1-己醇在紫林山西陳醋中含量最高,為107.21μg/L,在恒順香醋中含量最低,為62.13μg/L。結果表明,不同食醋中羥甲基糠醛的含量差異顯著(P＜0.05)。

由表4可知,食醋中含有較高濃度的糠醛和5-甲基糠醛,尤其經過固態發酵的山西紫林陳醋和恒順香醋中的糠醛和5-甲基糠醛遠高于其他樣品。固態發酵食醋發酵溫度高,陳釀時間長,美拉德反應持續生成了大量風味物質,特殊的加工過程更加劇了美拉德反應,使糠醛類風味物質大量產生,而液態發酵食醋僅能產生少量的糠醛類風味物質[1]。ABRAHAMK等[28]根據毒理實驗指出,正常人群每天食用不超過80～100 mg/kg體質量糠醛類物質(如5-甲基糠醛和糠醛),不會產生不良反應。以正常成年男性平均體質量為70kg計算,每天食用羥甲基糠醛衍生物5600～7000mg才會引起不良反應,以羥甲基糠醛衍生物含量較高的恒順香醋和紫林山西陳醋計算,每天至少需要食用933.33L以上食醋才會引起不良反應,所以人們正常食用的醋量不會危害人體健康。

表4 幾種市售樣品中羥甲基糠醛衍生物的測定結果Table4 Determination results of hydroxymethylfurfural derivatives of several commercial samples

3 結論

本研究使用SPME/GC-MS方法分析市售食醋中羥甲基糠醛衍生物。從食醋中鑒定出了糠醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇共3種羥甲基糠醛衍生物成分。這3種成分含量在3.33～666.67μg/mL范圍內,標準曲線回歸方程的R2＞0.990,加標回收率范圍為81.62%～96.47%,日內準確度在88.50%～94.05%,日間準確度范圍在84.09%～93.17%,日內精密度RSD≤4.36%,日間精密度RSD≤8.02%。使用該方法測定五種食醋樣品中的羥甲基糠醛衍生物含量,其中糠醛含量范圍在179.23～6 809.20μg/L之間;5-甲基糠醛含量在260.47～684.27μg/L之間;2-乙基-1-己醇含量在62.13～107.21μg/L之間。該方法能夠準確分析各類食醋中羥甲基糠醛衍生物的含量差異。但未來還需要進一步對羥甲基糠醛衍生物的毒性進行研究,需要弄清羥甲基糠醛衍生物對人體的具體危害以及相應的機理,以得到相關毒理學數據,填補我國在這一領域的研究空白。