β-隱黃素對實驗性牙周炎大鼠氧化應激的影響

崔曉宇，王國芳，李小紅，張 朋 ，李冬雪，軒亞茹

牙周炎是由菌斑微生物與宿主組織相互作用引起的牙周支持組織的炎性感染性疾病，主要表現為軟組織破壞和牙槽骨喪失，是成年人牙齒松動和脫落的首要原因[1]。近年來，各種證據表明氧化應激在牙周炎的發生發展機制中起重要作用。在炎癥狀態下，活性氧自由基的過度產生導致機體氧化應激和抗氧化防御系統失衡，從而對組織細胞產生損傷[2]。減少氧化損傷和增加抗氧化能力是治療牙周病的關鍵。β-隱黃素，是一種已被證實的具有多種生物活性的類胡蘿卜素，廣泛存在于柑橘、玉米、豌豆等多種果蔬中，其生物安全性已被認證[3]。Liu et al[4]研究顯示β-隱黃素可以抑制鎘誘導的大鼠睪丸組織的氧化應激反應。因此，推測β-隱黃素可能在牙周組織的氧化應激中具有一定的保護作用。然而，有關此方面的研究尚未見報道。該研究旨在初步探討β-隱黃素如何影響內毒素(lipopolysaccharide, LPS)/結扎誘導的牙周炎大鼠氧化應激反應以及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑及器械β-隱黃素(美國Sigma公司)；LPS(索萊寶生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(南京建成生物技術公司)；顯微照相系統(日本Olympus公司)； Leica SM 2000R切片機(德國徠卡Microsystems Nussloch公司)；TDL-5離心機(上海安寧科學儀器廠)；DW-86L626立式超低溫保存箱(青島海爾公司)；顯微外科器械。

1.2實驗對象選取8周齡雄性 SD大鼠30只，280～330 g，由山東省濟南市實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(魯)2014-0007。動物分籠飼養，自由攝食、飲水，適應性喂養一周。

1.3牙周炎動物模型的建立方法隨機取10只大鼠為正常對照組，剩余動物以7%的水合氯醛按3 ml/kg體重腹腔注射麻醉。采用口腔正畸結扎絲(直徑0.2 mm)環繞雙側上頜第二磨牙牙頸部一圈，結扎絲盡量靠近齦緣，于腭側打結壓向牙齒舌面，盡量避免損傷牙齦上皮。定期觀察結扎絲是否移位或脫落。同時在相應牙頰腭側齦溝內注射LPS(30 μl/只)[5]，每48 h注射1次。當牙齦出現紅腫、糜爛、輕探易出血、牙齒松動等癥狀時則造模成功。將20只建模成功的牙周炎大鼠再隨機分為牙周炎組和β-隱黃素治療組。β-隱黃素治療組在注射LPS后于相同位點注射β-隱黃素(12 μg/只)[6]，每48 h一次。作為對照，牙周炎組注射等劑量的生理鹽水。

1.4樣本采集于給藥后第7天，以10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射深度麻醉后行腹主動脈采血，室溫下靜置30 min～1 h, 3 000 r/min離心15 min取上清液，分裝至已登記編號的離心管中，-80 ℃保存備用。采用脫頸法處死大鼠，取雙側上頜骨。左側上頜骨(含牙齦、牙齒、牙槽骨)稍作修剪去除多余組織后，置于10%中性福爾馬林固定液中，登記編號，4 ℃保存備用。右側上頜骨取第二磨牙周圍牙齦組織，立即以4 ℃冰生理鹽水漂洗去除表面血液，濾紙吸干，分裝編號，-80 ℃保存備用。

1.5組織病理學分析左側上頜骨固定48 h以上后，取出結扎絲，并在10% EDTA脫鈣液中脫鈣，脫水，二甲苯清洗，石蠟包埋。沿磨牙近遠中方向切成4 μm的切片，每個樣本收集3張切片，用HE溶液染色，顯微鏡下挑片，進行組織學分析。

1.6牙齦組織和血清中相關指標檢測牙齦組織：組織塊稱重，冰浴速剪置于組織勻漿器中，加入預冷的勻漿介質(pH 7.4，0.01 mol/L 蔗糖，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA2Na 溶液)按組織塊重量：勻漿介質體積為1 ∶9制備10%的組織勻漿, 4 ℃、3 000 r/min離心15 min, 取上清液。血清：復溫至室溫。采用試劑盒檢測牙齦組織和血清中的 MDA、SOD及GSH-Px的活性： MDA檢測采用硫代巴比妥酸法(TBA法)；SOD檢測采用黃嘌呤氧化酶法；GSH-Px活力檢測采用雙硫代對硝基苯甲酸比色法(DTNB法)，以上操作均嚴格遵守試劑盒說明書。

2 結果

2.1組織學分析-HE染色結果選擇大鼠上頜第一和第二磨牙之間的區域為代表，圖像放大40倍：正常對照組大鼠牙周組織包括充滿鄰間隙的牙齦乳頭，牙槽骨嵴頂外形邊緣整齊，結合上皮附著于釉牙骨質界處(cemento-enamel junction, CEJ)，見圖1A1；相反，牙周炎組結合上皮位于CEJ的根方，于牙面剝離，有深牙周袋形成，見圖1B1；β-隱黃素治療組結合上皮位于CEJ稍下方處，牙周袋變淺，見圖1C1。圖像放大200倍：正常對照組結締組織內有極少量炎癥細胞浸潤，牙周膜纖維排列有序，見圖1A2；牙周炎組結締組織內有大量炎癥細胞浸潤，膠原纖維排列紊亂甚至斷裂，牙周膜間隙增寬，牙槽骨出現不規則吸收，嵴頂邊緣不整，見圖1B2中a、b標記處；β-隱黃素治療組結締組織內見少量炎癥細胞浸潤，牙周膜纖維排列整齊，牙周膜間隙稍增寬，牙槽嵴頂邊緣較整齊，有少量骨吸收，見圖1C2中c、e標記處。

圖1 大鼠磨牙間牙周組織學觀察 HE染色

A:正常對照組；B:牙周炎組；C: β-隱黃素治療組；1：×40；2×200；G:結締組織；PL:牙周韌帶；D:牙本質；AB:牙槽骨；黑色箭頭所示為釉牙骨質界(CEJ)

2.2氧化標志物水平檢測牙齦組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的變化：與正常對照組比較，牙周炎組MDA的生成水平顯著增高且SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與牙周炎組比較，β-隱黃素治療組MDA的生成水平顯著降低且SOD和GSH-Px活性明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 β-隱黃素給藥對大鼠牙齦組織中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常對照組比較：#P<0.05; 與牙周炎組比較：*P<0.05

表2 β-隱黃素給藥對大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常對照組比較：#P<0.05; 與牙周炎組比較：*P<0.05

血清中MDA含量、SOD和GSH-Px活性的變化：與正常對照組比較，牙周炎組MDA的生成水平顯著增高且SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與牙周炎組比較，β-隱黃素治療組MDA的生成水平顯著降低且SOD和GSH-Px活性明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

牙周炎的發生是多種危險因素作用的結果，其中牙周致病菌刺激宿主免疫/炎癥反應，使得中性粒細胞(PMN)和吞噬細胞被趨化和激活，侵入牙周組織并誘導蛋白水解酶的釋放和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產生。ROS的大量產生引發了一系列降解和破壞細胞膜的連鎖反應并生成過氧化脂質，最終分解成次級產物如MDA。另一方面，機體產生各種抗氧化酶以抵消過量的ROS并修復損傷，包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH-Px。當機體的抗氧化防御系統不能及時清除有害的ROS時，ROS將在組織內蓄積，導致氧化應激形成，造成或加重牙周組織損傷[7]。因此，尋求具有抗氧化作用且副作用少，成本較低的化合物是防治牙周炎的一種重要途徑。

近年來，Sanbe et al[8]研究表明非酶促抗氧化劑的攝入可降低牙周病變組織中炎癥細胞的浸潤數目和脂質過氧化的水平，提高牙周炎的愈合能力。β-隱黃素作為一種具有抗氧化性能的天然化合物[4]，可能對緩解牙周炎的發病進程起有效作用。本實驗使用LPS/結扎聯合誘導牙周炎動物模型，建模大鼠5 d后出現牙齦緣紅腫糜爛，輕度萎縮，輕探出血。頜骨組織病理學結果顯示，與正常對照組比較，牙周炎組結合上皮根方遷移，炎癥細胞浸潤和牙槽骨破壞明顯，說明本實驗成功建立了實驗性牙周炎大鼠模型。而β-隱黃素治療組與牙周炎組相比，結締組織內炎性細胞浸潤數目以及結合上皮根方遷移的距離和牙槽骨吸收量均明顯減少，說明了β-隱黃素對減輕牙周支持組織的炎癥和破壞起一定的積極作用。

牙齦組織中各種成分變化是牙周病最直觀的表現[9]。此外，外周血中氧化標志物的變化可以反映牙周組織的局部炎癥與全身氧化應激狀態的關系[10]。本實驗從大鼠牙齦組織和外周血中檢測和比較MDA含量以及SOD、GSH-Px的活性。結果顯示，與正常對照組比較，牙周炎組大鼠的牙齦組織和血清中的MDA含量明顯增高，而SOD和GSH-Px的活性明顯降低，表明大鼠牙周組織的氧化應激反應顯著，同時也與全身氧化應激狀態密切相關，與研究[11-12]報道的結果相一致。這是由于炎癥細胞產生過量的氧自由基，而消除氧自由基的固有氧化劑含量不足引起的。給予β-隱黃素后顯示，與牙周炎組比較，用藥組牙齦組織和血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量降低，表明了外源性補充β-隱黃素可以減輕氧化應激反應，提高機體的抗氧化能力，對牙周組織起到保護作用。

此外，Matsumoto et al[6]研究發現，β-隱黃素可以抑制LPS誘導的破骨細胞形成以及大鼠牙槽骨吸收。Nishigaki et al[3]體外實驗發現β-隱黃素可以抑制人牙周膜細胞對機械應力和牙周致病菌共同誘導的IL-6和IL-8的表達并上調OPG的產生。課題組前期研究[13]顯示，給予β-隱黃素治療的牙周炎大鼠牙周組織內成熟的破骨細胞數目明顯少于牙周炎組，RANKL/OPG的比值下調。這一系列的細胞及動物實驗研究證實β-隱黃素可以通過抑制炎癥細胞因子的表達和破骨細胞的形成來減輕牙周病變組織的炎癥和骨喪失。

綜上所述，β-隱黃素具有良好的抗炎和抗氧化作用，在牙周炎的防治中有潛在的應用價值。但目前關于β-隱黃素在牙周炎中具體作用機制的研究尚不全面，以及β-隱黃素的用藥劑量、給藥途徑和時間也不明確，需要大量的實驗來進一步探索。