4-NQQ誘導小鼠舌癌形成過程中的血清差異蛋白篩選

李 邦，王 飛，張亞軍，劉來奎，孫應明

全球每年約35萬人被診斷為口腔癌，其中舌癌約占40%左右，為最常見的口腔癌[1]。近年來舌癌的發病率有上升趨勢，且其早期診斷困難并伴有高轉移率，所以盡管最近提出了很多新的治療方法，但患者的5年生存率一直未見明顯的提高，僅50%左右[2]。因此尋找舌癌的早期診斷標志物以及探索舌癌形成的機制變得越來越重要。目前舌癌的發病機制尚不明了，研究[3]表明長期的小劑量接觸致癌物導致基因突變可引起組織發生惡性轉化而發生癌變。其中蛋白組學技術能全面地檢測生物體全部蛋白質的表達模式和功能模式，并且在腫瘤的早期篩選、探索腫瘤治療的新靶點中發揮重要的作用。在致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQQ)誘導舌癌模型中，整個實驗歷時較長，經歷小鼠生長發育的整個時期，與人類舌黏膜癌變過程相類似，能很好地模擬人舌癌形成的過程[3]。該研究采用4-NQQ誘導小鼠舌黏膜癌變，然后取3個特定時間點小鼠血清行蛋白組學分析，篩選舌癌形成過程中其血清的差異表達蛋白，以期篩選出舌癌早期診斷的腫瘤標志物。

1 材料與方法

1.1實驗動物及舌癌模型誘導100只C57BL/6小鼠(雌雄隨機)，SPF級，鼠齡6～8周，購自南京醫科大學醫學實驗動物中心。將100只小鼠隨機分為10組，每組10只。在10組小鼠中，隨機挑選5組為實驗組，5組為對照組。實驗組飲用水中加入4-NQQ，濃度為0.004%，對照組小鼠正常飼養。分別在8、12、16、20、24周時處死小鼠，取舌頭。右心室取小鼠靜脈血，1 000 r/min離心20 min，取上清血清，-80 ℃保存，避免反復凍融。

1.2小鼠舌黏膜組織病理學觀察在特定時間點處死小鼠后取舌頭，浸泡在4%多聚甲醛中，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。舌癌的組織學分析：在雙盲實驗中，兩名病理醫師為小鼠舌黏膜病變程度打分，使用如下打分系統：0=無改變；1=輕度異型增生，上皮的紊亂及細胞異型局限在上皮下1/3；2=中度異型增生，上皮紊亂及細胞異型局限在上皮的中1/3；3=重度異型增生，上皮的紊亂及細胞異型超過上皮的2/3；4=浸潤癌，腫瘤細胞突破基底膜沿舌肌向下浸潤。

1.3iBT定量蛋白組學分析在小鼠舌黏膜出現典型病變時取小鼠靜脈血清即在8周(舌黏膜開始出現異常時)、16周(輕度異型增生)、24周(開始出現浸潤癌)時。隨機取其中5只小鼠血清混合后(滿足iBT實驗所需，剩余血清進行其他實驗)行iBT定量蛋白組學分析(深圳華大基因)，血清蛋白按如下步驟進行分析：蛋白提取、蛋白酶解、肽段標記、肽段分離、質譜檢測。原始數據獲得后進行如下分析：選擇蛋白數據庫、Mascot(版本為Mascot2.3.02)搜索使用、蛋白iBT定量、差異蛋白通路富集分析。當蛋白差異滿足差異比值>1.5及P<0.05時，認為該蛋白為差異蛋白。

1.4統計學處理差異蛋白統計學分析使用IQuant軟件(華大基因)，IQuant顯示蛋白差異有統計學意義是根據Benjamini-Hochberg計算法中的多重假設分析。

2 結果

2.1舌癌模型誘導為了探索舌癌形成過程中，血清蛋白表達的變化，為舌癌的治療及早期診斷提供依據。在小鼠的飲用水中加入4-NQQ誘導小鼠舌黏膜癌變。在成瘤實驗過程中，小鼠在16周時開始出現活動性下降，20周時小鼠成堆蜷縮在籠子一角，厭食，活動減少，且1只實驗組小鼠死亡(死亡原因不明)，24周時小鼠毛發稀疏無光澤，頦部可見食物碎屑結痂且潮濕，部分小鼠呈惡病質狀瀕死狀，部分小鼠體重僅16 g左右。小鼠舌外觀8周時開始出現鄒縮、粗糙，20周時開始出現疣狀物凸起及白斑，24周時小鼠出現疣狀物凸起的比例增加，且單個舌頭上疣狀物的數量増多(圖1 A)。病理學結果如下：其中8周時10只小鼠舌黏膜均無明顯異型增生，但部分小鼠舌黏膜出現增生及過角化；12周時70%出現輕度異型增生；16周時100%出現輕度異型增生；20周時33.33%出現輕度異型增生，44.44%出現中度異型增生，22.22%出現重度異型增生。24周時10%小鼠出現浸潤癌，10%重度異型增生，60%中度異型增生，20%輕度異型增生(圖1 B、表1)。

2.2iBT定量蛋白組學分析兩個對比組即8周/16周和16周/24周共發現差異蛋白194種，其中8周/16周共檢測到89種差異蛋白，其中62種上調蛋白，27種下調蛋白，16周/24周共檢測到105種差異蛋白，其中43種上調蛋白，62種下調蛋白(圖2 A)。其中差異蛋白通路富集分析提示：RAS信號通路、NF-κB通路、PI3K信號通路、Pathway in cancer信號通路、Proteoglycans in cancer信號通路、JAK-STAT信號通路、microRNA in cancer信號通路在舌癌形成過程中持續異常。在8周和16周對比組中發現癌相關蛋白：纖連蛋白(Fibronectin，FN)和原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPMI)低表達。在16周和24周的對比組中發現癌相關蛋白Four and a half LIM domains protein 1(FHL1)、FN、熱休克蛋白(heat shock protein 84b，HSP 84b)、serine/threonine-protein (PP2A)、蛋白聚糖 4(Proteoglycan 4，ECM)、14-3-3 protein gamma subtype and MCG126220 and Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(14-3-3)低表達(圖2B、表2)。

圖1 4-NQQ誘導小鼠舌黏膜癌變

異型增生登記8周實驗組對照組12周實驗組對照組16周實驗組對照組20周實驗組對照組24周實驗組對照組01010310010010010100701003020200000040603000000201040000000010合計1010101010109101010

表2 蛋白組學結果：3個時間點兩個對比組的差異蛋白

3 討論

舌癌作為最嚴重的口腔疾病，但是常常被人認為是其他口腔疾病如口腔潰瘍、舌腫塊等而被忽視，由于其早期轉移率高，大多數在確診時常常已發生了頸淋巴結轉移，給治療帶來很大的困難。并且由于其缺乏早期診斷標志物，且常常被忽視，因而早期發現并診斷舌癌變得異常困難。

蛋白組學技術具有高敏感性和特異性，能廣泛地分析鑒定蛋白質，在腫瘤的特異性標志物的篩選及腫瘤形成機制的研究中發揮著越來越重要的作用。血液是臨床體檢、疾病篩查等工作中常見的樣本，其中血清中含有大量的免疫球蛋白和異質組織蛋白，在使用血清作為臨床篩選腫瘤的工作中已取得大量進展，在早癌的篩查中扮演越來越重要的作用。

圖2 iBT定量蛋白組學結果

A：兩個對比組差異蛋白總覽；B：腫瘤相關的差異蛋白各時間點變化折線圖

因此課題組使用4-NQQ誘導舌癌模型，在特定的時間點取小鼠血清行蛋白組學分析，希望能篩選出有利于舌癌早期診斷的標志性蛋白質。在小鼠舌癌模型誘導方面，整個實驗耗時6個月，模型誘導實驗結束時小鼠開始出現浸潤性舌癌，但浸潤癌出現的比例不高，主要是由于小鼠狀態不佳，部分惡病質體重僅16 g左右，呈現瀕死狀態，因而不得已結束小鼠舌癌誘導實驗。誘導實驗中使用小劑量致癌物長期刺激小鼠舌黏膜，且經歷了小鼠生長發育的整個時期(性成熟期至中老年期)，小鼠的舌黏膜病理改變從輕度異型增生到中度異型增生，然后為重度異型增生，最后發展為浸潤癌，該過程與人類舌癌的形成過程相類似，能很好地模擬人舌癌的形成過程與誘因[4]。

蛋白組學分析一共發現差異蛋白194種，其中8周/16周共檢測到89種差異蛋白，其中62種上調蛋白，27種下調蛋白，16周/24周共檢測到105種差異蛋白，其中43種上調蛋白，62種下調蛋白。其中癌相關蛋白FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等在舌癌形成的過程中有明顯差異，未有文獻明確報道其能作為舌癌的早期診斷標志物。但有多篇文獻[5-8]報道指出它們在腫瘤形成過程中表達紊亂。例如FHL1為腫瘤形成過程中的抑制劑，在腫瘤的形成和進展中發揮重要的作用，蛋白組學的結果提示其在舌癌形成的過程中對比8周持續低表達[5]。基質及細胞中的FN能預測舌癌的進展及轉歸，當其在腫瘤基質中低表達時舌癌的預后較好，結果提示其在小鼠舌癌形成的過程中低表達[6]。HSP27在舌癌的原發灶中的表達量與腫瘤的低分化關系密切，且其高表達提示患者有個良好的預后，蛋白組學的結果提示HSP 84b在舌癌形成中低表達[7]。PP2A被報道其有可能作為腫瘤的抑制器，蛋白組學的結果提示其在舌癌中高表達，特別是在腫瘤形成的最后階段即16至24周時[8]。通路分析結果提示癌相關通路如：NF-κB通路、PI3K信號通路、JAK-STAT信號通路等信號通路在舌癌的免疫治療被廣泛應用[9-10]。由于蛋白質學僅僅是初步篩選未能驗證，因此課題組下一步計劃在人舌癌及正常組織標本中驗證蛋白組學中檢測的蛋白質如FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等，且對蛋白組學中檢測到的可能的異常通路進行驗證，進一步揭示舌癌形成的機制，為舌癌的早期診斷提供新的標志物。