堿性磷酸酶的酶學性質研究及其在心肌標志物免疫檢測中的應用

劉秀菊

（廣東省深圳市龍崗區婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳 518000）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一種水解酶，在堿性環境中能水解很多磷酸單酯化合物。該酶的用途廣泛，它可以作為某些疾病的標志物，也經常用于在酶聯免疫吸附反應（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 中標記抗體或抗原，進而幫助檢測相應的抗原或抗體的含量。堿性磷酸酶的酶學性質已經得到廣泛研究，如從不同物種中提取此酶，研究它的Km和Vmax值、最適pH和最適反應溫度等基本性質，從而比較不同物種之間堿性磷酸酶的差異[1-3]。但是對堿性磷酸酶活性的其他影響因素（如緩沖液、NaN3、聚乙二醇等）研究較少。另外，這些實驗多采用分光光度法跟蹤堿性磷酸酶催化對硝基苯酚磷酸鹽在水溶液中水解生成對硝基苯酚的反應，都是基于產物在水溶液中的摩爾吸光系數不變的情況下來測定酶的活性。不同種類、濃度和pH的緩沖溶液對產物的摩爾吸光系數影響很大，這直接影響到文獻中有關堿性磷酸酶活性研究的準確性，因此有必要進行報道。

急性心肌梗死是一種發病率和死亡率很高的疾病。它的常用標志物有肌紅蛋白、肌酸激酶、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins,cTn）I、T，C-反應蛋白（C-reactive protein,CRP）等。其中，cTnI是當今公認的“黃金標志物”。2000年，歐洲心臟病學會和美國心臟病學會進一步強調了cTn家族（I、T）的檢測對于急性心肌梗死的確診是十分必要的[4-5]。CRP的用途非常廣泛，它不僅可以用于診斷心肌梗死，還常用于各種慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、風濕及手術創傷等疾病的輔助診斷和治療檢測[6]。因此，對cTnI和CRP的定量檢測備受重視。

本文分析了不同緩沖液、疊氮化鈉（NaN3）、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）對AP酶促反應動力學的影響，并且建立了堿性磷酸酶的心肌梗死標志物cTnI、CRP的雙抗體夾心式ELISA檢測體系，為堿性磷酸酶的實際應用提供有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

小牛腸堿性磷酸酶（30 u/μl）購于寶生物工程(大連)有限公司，對硝基苯酚磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate hexahydrate disodium,PNPP）購于美國Amresco公司，cTnI質控品和CRP標準品以及cTnI的抗體（檢測抗體16A11、包被抗體19C7）購于芬蘭Hytest公司，CRP抗體（檢測抗體4C28C6、包被抗體4C28C2）購于美國International Immunology Corporation公司，用于去除酶-抗體結合物中游離酶的試劑盒（FreeZyme Conjugate Purification Kit）、脫鹽柱（D-Salt Polyacrylamide 6000 Desalting Columns）、用于合成酶-抗體結合物的交聯劑LC-SMCC（Succinimidyl-4-［N-Maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxy-［6-amidocaproate］）以及β-巰基乙胺（β-mercaptoethylamine，MEA）購于美國的Pierce公司，其他試劑均為國產分析純。

ELISA試劑：包被液TBS（0.025 M Tris,0.15 M NaCl，pH 7.4），封閉液TBS+1% BSA（w/v），稀釋液TBS+0.5% BSA（w/v）+0.05%吐溫20（v/ v），洗滌液TBS+0.05%吐溫20（v/v），終止液1 M NaOH。

1.2 對硝基苯酚摩爾吸光系數的測定

對硝基苯酚（p-nitrophenol,PNP）是在堿性磷酸酶催化下底物PNPP的水解產物，該產物呈黃色，在405 nm處有強烈吸收。本研究選用了5種常用的緩沖液：碳酸鈉/碳酸氫鈉（Na2CO3/NaHCO3）緩沖液（0.1 M，pH 9.8），三羥甲基氨基甲烷/鹽酸（Tris/HCl）緩沖液（0.05 M，pH 9.8），巴比妥鈉／鹽酸緩沖液（0.1 M，pH 9.8），硼砂/氫氧化鈉（Na2B4O7/NaOH）緩沖液（0.05 M，pH 9.8），二乙醇胺（DEA）/鹽酸緩沖液（1.0 M，pH 9.8）。將PNP溶解在這5種緩沖液中，配成濃度為1、2.5、5、7.5、10 μM的溶液，測其在405 nm處的吸光度。以PNP溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，所得斜率即為產物在該緩沖溶液中的摩爾吸光系數。本文還研究了不同濃度和pH的DEA緩沖液對PNP摩爾吸光系數的影 響。

1.3 堿性磷酸酶活性的研究

在2.5 ml的反應體系中，緩沖液2.025 ml，底物PNPP（100 mM）0.375 ml，堿性磷酸酶（30 mu）0.1 ml，pH為9.8，在37℃下，測定405 nm處的吸光度變化，通過上述體系，研究緩沖液、pH、NaN3、PEG對酶促反應的影響，并測定其動力學常數。

1.4 PEG對堿性磷酸酶穩定性影響的研究

將堿性磷酸酶液和PEG混合，使PEG在酶液的濃度為100 mg/ml，50℃水浴，每隔一定時間取出0.1 ml混合液，參考1.3的反應體系，測堿性磷酸酶活性，比較該酶在50℃的活性變化及不同分子量的PEG對其穩定性的影響。

1.5 堿性磷酸酶在檢測cTnI和CRP的雙抗體夾心式ELISA中的應用

1.5.1 堿性磷酸酶-抗體結合物的制備 堿性磷酸酶（25 u/μl，20 μl）和 LC-SMCC（50 mg/ ml，10 μl）混合，室溫反應1 h，形成被活化的酶，過脫鹽柱，去除多余的LC-SMCC，收集被活化的酶。抗體（11.3 mg/ml，0.09 ml）和MEA（250 mg/ ml，10 μl）混合以生成Fab，室溫反應1 h后，過脫鹽柱，去除多余的MEA，收集Fab組分。將被活化的酶和Fab組分按一定摩爾比（標記cTnI和CRP抗體的摩爾比分別為4︰1和1︰1）混合以合成酶-抗體結合物，4℃過夜后，用FreeZyme Conjugate Purification Kit去除游離酶，將收集到的酶-抗體結合物保存于該試劑盒提供的貯存緩沖液，并與等量的乙二醇混勻，置于-20℃冰箱中保存。

1.5.2 檢測cTnI和CRP的雙抗體夾心式ELISA方法的建立及性能評價 建立檢測cTnI和CRP的ELISA檢測體系。采用棋盤法，進行以下條件的篩選：包被抗體濃度（1、5、10、100 μg/ml），封閉液濃度（0.1%、0.5%、1%、3%、5%BSA溶液），cTnI酶-抗體結合物稀釋度（1︰10、1︰20、1︰100、1︰1 000），CRP酶-抗體結合物稀釋度（1︰100、1︰1 000、1︰2 000、1︰5 000），PNPP 濃度（10、100 mM），酶與底物作用時間（10、20、30、50 min）。選擇不同濃度梯度的cTnI和CRP，以cTnI或CRP濃度為橫坐標，在405 nm處的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并測定該方法的靈敏度、線性范圍、穩定性。

2 結果

2.1 緩沖液的種類、濃度和pH對產物摩爾吸光系數的影響

緩沖液的種類、濃度和pH對PNP的摩爾吸光系數都有一定的影響，而且產物的摩爾吸光系數隨溶液的濃度增加而增加，也隨溶液的pH增加而增加。見表1。

表1 緩沖液的種類、濃度和pH對PNP摩爾吸光系數的影響

2.2 不同緩沖液對酶促反應速度的影響

研究表明，堿性磷酸酶在這5種緩沖液顯示不同的反應活性。在DEA緩沖液中的酶促反應速度最高。其他4種緩沖液中的反應速度僅能達到DEA緩沖液中的45%～62%。見圖1。因此，在后續實驗中，均選用DEA緩沖液作為反應介質。

圖1 不同緩沖溶液對堿性磷酸酶的影響

2.3 NaN3對酶反應速度的影響

在反應體系中添加NaN3使其終濃度為5～30 mM，結果表明NaN3對堿性磷酸酶動力學常數Km和Vmax沒有明顯影響，證實堿性磷酸酶保存液中的NaN3作為防腐劑不影響酶的活性。

2.4 聚乙二醇對酶活性和穩定性的影響

PEG對堿性磷酸酶的動力學常數沒有明顯影響，但是不同分子量的PEG都能使酶的穩定性有一定的提高，如圖2所示。但其穩定化作用與PEG的分子量沒有明顯的直接關系。見圖2。

圖2 PEG對堿性磷酸酶熱穩定性的影響

2.5 堿性磷酸酶在檢測cTnI和CRP的ELISA中的應用

檢測cTnI的ELISA檢測體系的最適條件為：包被抗體為10 μg/ml，封閉液為1%BSA，檢測抗體-酶稀釋度為1︰20，底物PNPP為10 mM，底物和酶作用時間為20 min。線性范圍為0.45～75.2 ng/ml，批內變異系數≤4.74%，批間變異系數≤9.21%。檢測CRP的ELISA檢測體系的最適條件為：包被抗體為10 μg/ml，封閉液為1%BSA，檢測抗體-酶稀釋度為1︰5 000，底物PNPP為10 mM，底物和酶作用時間為20 min。線性范圍為5～100 ng/ml。批內變異系數≤7.745%，批間變異系數≤11.73。見圖3。

圖3 檢測cTnI和CRP的ELISA標準曲線

3 討論

堿性磷酸酶是一種堿性水解酶，用途非常廣泛，它可以作為某些疾病的標志物[4-5]，也經常被用于在ELISA中標記抗體或抗原，進而幫助檢測相應的抗原或抗體的含量[6-7]。堿性磷酸酶的酶學性質已經得到廣泛研究，但是對堿性磷酸酶活性的其他影響因素（如緩沖液、NaN3、聚乙二醇等）研究較少[8-10]。另外，這些實驗多采用分光光度法跟蹤堿性磷酸酶催化對硝基苯酚磷酸鹽在水溶液中水解生成對硝基苯酚的反應，都是基于產物在水溶液中的摩爾吸光系數不變的情況下來測定酶的活性。本研究發現，不同種類、不同濃度和不同pH的緩沖溶液對產物的摩爾吸光系數影響很大，這直接影響到文獻中有關堿性磷酸酶活性研究的準確性。

急性心肌梗死是一種發病率和死亡率很高的疾病。當今公認的“黃金標志物”是心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins I,cTnI）。2000年歐洲心臟病學會和美國心臟病學會進一步強調了cTn家族（I、T）的檢測對于急性心肌梗死的確診是十分必要的[11-12]。CRP的用途非常廣泛，它不僅可以用于診斷心肌梗死，還常用于各種慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、風濕、手術創傷等疾病的輔助診斷和治療檢測[13]。因此，對cTnI和CRP的定量檢測備受重視。

堿性磷酸酶的酶促反應試驗中，產物PNP的摩爾吸光系數多采用一個定值（17.3 mM-1cm-1），因為普遍認為PNP的摩爾吸光系數不隨反應介質及其濃度和pH值而改變[14]。本文還首次系統地研究了緩沖液的種類、濃度和pH對反應產物PNP的摩爾吸光系數的影響，發現不同種類、不同濃度和不同pH的緩沖液中產物PNP的摩爾吸光系數不同。因此，測定堿性磷酸酶的酶活性時要根據不同的反應條件選擇產物PNP不同的摩爾吸光系數，以保證實驗結果的準確性。在研究的5種緩沖液中，DEA緩沖液是激活型緩沖液，不僅能給堿性磷酸酶催化反應提供緩沖作用，還可以作為磷酸酰基的受體，提高催化反應的速度[15]。在堿性磷酸酶的應用中，參考這些最適條件，應用效率會得到很大的提高。NaN3是一種防腐劑，可以抑制微生物的生長，是堿性磷酸酶保存液的必備成分之一。研究發現，NaN3對堿性磷酸酶的動力學性質沒有影響。聚乙二醇對酶具有一定的穩定化作用。

以上的酶學性質的研究對兩種心肌標志物的ELISA檢測體系的建立起到一定的幫助作用。cTnI和CRP免疫檢測體系的建立，達到很好的檢測靈敏度和精確度，這對開發心肌標志物的ELISA檢測試劑盒有很好的應用價值。