七葉一枝花地上部分總黃酮的測定研究

張玉霖 余海峰 周亮 張又枝（通訊作者） 陳錦紅

（湖北科技學院藥學院 湖北 咸寧 437100）

七葉一枝花(Paris polyphylla)為重樓屬多年生草本植被，屬十分珍貴的藥材，有悠久的藥用歷史，具有抗菌抑菌、止血消炎、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[1]。包括七葉一枝花在內的重樓屬植物，其藥用成分主要為皂苷、黃酮類等物質[2]。黃酮類化合物具有抗病毒、抗氧化、預防心腦血管疾病、抗腫瘤、清除自由基等多方面的功用[3]。由于目前七葉一枝花常用根部入藥，而其地上的莖、葉部分常被丟棄，為更充分利用七葉一枝花的現有資源，測定其莖、葉不同部位總黃酮，給合理利用整株七葉一枝花提供理論依據。本文參考相關文獻[4-6]，選用蘆丁為對照，利用蘆丁和鋁的絡合物產生熒光的原理來測定七葉一枝花中總黃酮的含量，結果滿意。

1.材料與儀器

1.1 材料

七葉一枝花地上莖、葉，采購于長陽澤昊中藥材種植基地。蘆丁對照品（批號161223，購自上海圻明生物科技有限公司），硝酸鋁、乙酸鈉、甲醇、無水乙醇、乙酸等均為分析純。

1.2 儀器

RF-5301型熒光分光光度計(日本島津)；KQ3200DB型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；萬分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；DHG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱（上海培因實驗儀器有限公司）；FW177型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；LDZ4-0.8低速自動離心機（北京醫用離心機廠）、PHS-3C型PH計（上海雷磁精密科學儀器有限公司）；RE-5299旋轉蒸發儀（鄭州市亞榮儀器有限公司）。

2.方法與結果

2.1 七葉一枝花總黃酮的提取方法

將七葉一枝花地上莖、葉分開，除雜洗凈，烘干粉碎。按照文獻[7]方法，精密稱取莖、葉樣品粉末各一定量加石油醚脫脂脫色后揮干，按液料比15：1加入90%乙醇超聲提取30min，重復提取2次，合并提取液，以90%乙醇定容至50mL。

2.2 測定條件的選擇

精密稱取蘆丁對照品，用90%乙醇配成0.5g·L-1的標準溶液，移取該溶液液0.8mL至25mL容量瓶，加入10% Al（NO3）3溶液1.6mL、不同PH（2.7、3.6、4.5、5.4）的HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用不同體積分數（50%，70%，90%，100%）乙醇定容，搖勻。考察乙醇體積分數、溶液PH對熒光測定的影響。在激發、發射狹縫寬度均為5nm條件下掃描，測得激發波長=430nm，發射波長=483nm。

不同體積分數（50%，70%，90%，100%）乙醇的影響結果見圖1。圖1表明，配合物的熒光強度基本隨著乙醇體積分數增加而增強，且乙醇體積分數變大后，最大峰位略微向右移動。當乙醇濃度為90%時，熒光強度明顯強于其它濃度。所以，本實驗選定90%乙醇為測定溶劑。

圖1 不同濃度乙醇溶劑的影響

不同PH緩沖溶液的影響見圖2，隨著溶液PH值的升高，熒光強度值先增高后減弱。可見不同PH的溶液會影響配合物的穩定性。當加入PH=3.6的緩沖溶液時，熒光強度最大，本實驗選擇加入PH=3.6的HAC-NaAC緩沖溶液。

圖2 不同PH的影響

2.3 標準曲線的繪制

分別吸取0.5g·L-1蘆丁標準溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mL于6只25ml容量瓶中，依次加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，最后用90%乙醇定容，即得蘆丁標準工作溶液。以試劑空白為參比，測定各蘆丁標準工作溶液的熒光強度，繪制標準曲線。結果表明，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1的范圍內與熒光強度呈良好線性關系，回歸方程為Y=33573X-13.715，Y表示熒光強度，X表示蘆丁濃度，相關系數r2為0.9991。

2.4 精密度試驗

取同一份樣品溶液平行測定6次，測得溶液中總黃酮濃度分別為 18.742、18.695、18.377、18.421、18.869、18.471ug·L-1，RSD為0.19%，表明方法精密度良好。

2.5 加標回收試驗

為了驗證本法測定的準確性，在樣品溶液中加入蘆丁對照品進行考察。準確稱取樣品6份，再加入不同量蘆丁標準溶液，按樣品測定方法提取、測定，結果見表。該方法平均回收率為96.55%，說明該方法準確可行。

表 七葉一枝花總黃酮回收率試驗

2.6 樣品測定

精密量取“2.1”項下莖、葉提取液各一定量，分別加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用90%乙醇定容至25mL，測定各溶液熒光強度，代入回歸方程，求得莖、葉中總黃酮含量分別為4.86、6.12mg·g-1。

3.討論

本文采用熒光分光光度法測定七葉一枝花總黃酮含量，考察了乙醇溶劑體積分數、溶液PH等對熒光強度的影響。實驗表明，在本文實驗條件下，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1范圍內與熒光強度有良好的線性關系，平均回收率為96.55%。熒光法對比傳統的紫外分光光度法靈敏度更高，且操作簡單，可以作為測定七葉一枝花總黃酮含量的方法。樣品測定結果表明，七葉一枝花地上的莖、葉中含有豐富的黃酮類化合物，可以充分利用。