追風透骨膠囊對脊髓損傷模型大鼠脊髓神經細胞凋亡的影響及其機制研究

黃旭陽，王舒涵，韓 冬，李潤輝

0 引言

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是嚴重的中樞神經系統創傷性疾病之一。2011年全國部分省市調查結果顯示，SCI發病率為23.7～60.6/100 000[1]，其主要原因為機動車事故(40.0%)或高空墜落(37.8%)[2]。SCI后常導致損傷組織的細胞凋亡等病理生理反應發生紊亂，從而嚴重影響脊髓相應節段神經束傳導功能，進而導致患者發生肢體麻木與癱瘓[3-5]。因此，尋找一條有效的途徑來降低SCI后細胞凋亡水平至關重要。Wnt信號通路與多種神經系統中發生的病理生理過程密切相關，如神經退行性病變、神經炎癥反應及神經細胞凋亡等。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可以抑制由脊髓損傷引起的神經元凋亡，進而促進運動神經元功能恢復[6]。追風透骨膠囊(Zhuifengtougu capsule，ZFTG)是由川烏總堿、天麻等24種藥材制成的中成藥，主要有祛風濕、通經絡、鎮痛祛寒等作用。臨床上主要應用于神經麻痹、手足麻痹、風寒濕痹、四肢痹痛等癥狀[7-8]。近年研究發現，追風透骨膠囊所含有的川烏總堿、蚯蚓素、天麻素、川芎嗪等多種活性物質可能與抗神經損傷有密切關系[7,9-10]。前期研究發現，ZFTG可以有效地激活Wnt/β-cantein信號通路并減少細胞凋亡。因此，本實驗擬探討追風透骨膠囊對SCI模型大鼠脊髓運動神經元的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠45只，8～10周齡，體重240～260 g。由沈陽醫學院動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證編號：SCXK(遼)2014-0004。

1.1.2 藥物 將追風透骨膠囊(湖南天地恒一)內粉末研碎至于PBS中，加熱并超聲波震蕩溶解，溶解后4 ℃保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：β-catenin抗體(Abcam公司)，LRP-6抗體(Abcam公司)，active Caspase-3抗體(Cell signaling公司)等。主要儀器：Biorad雙向電泳儀、通用電泳儀、大型水平、小型垂直電泳槽，Leica組織自動包埋機、冰凍切片機，Nanodrop ND2000檢測儀和Tecan酶標儀等。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應性飼養5 d。采用隨機數字表法將大鼠分為Sham組(假手術組)、Vehicle組(脊髓損傷組)、ZFTG組(治療組，20 mg/kg，濃度由人體用藥濃度換算)，每組15只。實驗大鼠用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，進行備皮-消毒-鋪單工作。Sham組只切開脊髓最高點的皮膚，鈍性分離組織并破壞椎板(相當于T10節段)，但是不損傷脊髓組織。Vehicle組在Sham組的基礎上，應用經典的Allen′s法(用脊髓打擊器打擊脊髓)制造SCI模型后，注射與ZFTG組相應劑量的PBS溶液。ZFTG組在Vehicle組的基礎上，腹腔注射已經配制好的追風透骨膠囊溶液。術后飼養于SPF級鼠房，每天喂食喂水并排尿2次。在飼養過程中，Sham組死亡1只，Vehicle組死亡3只，ZFTG組死亡1只。

1.2.2 大鼠行為學實驗(BBB評分) 本實驗采用Basso、Beattie、Bresnahan locomotor rating scale(BBB評分)評價大鼠SCI后運動功能恢復情況。分別在第2部分實驗術后第1、3、7、14、28天進行評分。簡單來說，BBB評分是觀察SCI后動物的踝、臀、膝關節，軀干運動及其協調情況，分數為0分(完全癱瘓)～21分(脊髓未受損傷)。所有BBB評分的工作均由4名有經驗的實驗者用雙盲的實驗方法共同完成。

1.2.3 組織準備與尼式染色 術后第7天，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，應用生理鹽水與4%多聚甲醛(PFA)依次灌流。灌流成功后取脊髓(T8～L2)，放置于4%多聚甲醛中固定。2 d后，用冰凍切片機切片，每張厚度20 μm(采用單盲法測量40張切片)，切好后貼在載玻片上，并放入-20 ℃ 冰箱保存，之后在室溫下晾干(30 min)。將切片放入氯仿乙醇(1∶1)中過夜，次日取出后三蒸水浸泡，洗3遍，放入37 ℃焦油紫中浸泡40 s，放入三蒸水，洗1遍，之后依次放入95%乙醇、無水乙醇、二甲苯溶液，最后取出后用中性樹膠封片。靜置1 d后光學顯微鏡照相檢測。

1.2.4 Western blot檢測 術后7 d，按上述方式，在冰浴條件下取脊髓組織提蛋白并用BCA法制樣。準備好樣品后上樣，電泳后轉膜(濕轉)、封閉，最后加一抗4 ℃過夜，第2天加相應的二抗。其中一抗分別是β-catenin(1∶1 000)、LRP-6(1∶1 000)、active Caspase-3(1∶800)、β-actin(1∶1 000)。隨后滴加適量的ECL顯色液上機檢測，最后用Image J軟件檢測條帶吸光度(A)值。

2 結果

2.1 追風透骨膠囊對SCI模型大鼠運動功能的影響 術后分別在第1、3、7、14、28天測定BBB評分。Sham組評分基本穩定在21分，ZFTG組與Vehicle組曲線均呈上升趨勢。但是與Vehicle組比較，ZFTG組的分數分別在損傷后第7、14天升高(P<0.05)，第28天分數明顯升高(P<0.01)，表明追風透骨膠囊與SCI模型大鼠的相關運動功能恢復有密切聯系。見圖1。

2.2 追風透骨膠囊對SCI模型大鼠脊髓前角運動神經元含量的影響 術后第7天，對切片進行尼式染色(神經元特異性染色)。結果顯示，大鼠脊髓前角運動神經元計數中，與Vehicle組比較，ZFTG組數量明顯升高(P<0.05)，表明追風透骨膠囊可以維持SCI模型大鼠的脊髓前角運動神經元的含量。見圖2。

圖1 各組大鼠的行為學檢測

2.3 追風透骨膠囊對SCI模型大鼠脊髓組織中β-catenin、LRP-6、active Caspase-3蛋白含量的影響 術后7 d，提取不同分組中大鼠的脊髓蛋白并制樣，進行Western blot實驗檢測上述蛋白的抗體。結果顯示，與Vehicle組相比，ZFTG組β-catenin蛋白特異性升高(P<0.01)，LRP-6蛋白表達被明顯激活(P<0.01)，提示β-catenin信號通路被激活。active Caspase-3蛋白表達被明顯抑制(P<0.01)，提示組織凋亡水平下降。見圖3。

3 討論

SCI包括原發性和繼發性損傷2個病理過程，其中繼發性損傷在運動神經功能恢復過程中起重要作用，損傷多由炎癥反應、氧化應激、凋亡、細胞自噬、組織水腫與瘢痕形成等因素引起[11-14]，而神經細胞凋亡水平的調控影響SCI后神經功能的恢復進程及結局[15]。但是，目前SCI后神經修復的具體分子機制尚不明確，因此，尋找SCI后神經功能恢復的具體分子機制以及闡述炎癥與凋亡等特異性病理生理變化在SCI后神經功能修復過程中的作用是SCI領域的一項重大課題。在當今醫學發展中，中醫中藥發揮著越來越重要的作用，已經有文獻報道了追風透骨膠囊的有效成分中草烏總堿、川烏總堿、蚯蚓素、天麻苷元等(12種)對抗炎有獨特的療效。此外，川芎嗪、天麻素等有效成分可以有效緩解神經損傷癥狀(如神經麻痹、肢體麻木等)[7-10]。前期試驗結果顯示，ZFTG可以有效調節組織凋亡水平，并且可以緩解神經損傷，然而其具體機制不清。

本課題首次揭示ZFTG調控SCI后凋亡水平，但ZFTG治療大鼠SCI方面研究較少，缺少可以直接借鑒的藥物濃度，因此，需要尋找一個有效的藥物濃度。我們根據ZFTG人體應用劑量估算出實驗濃度，并進行相關驗證。研究表明，動物行為學實驗(BBB評分)可以宏觀判斷一種干預手段是否切實有效，特別是在神經損傷與行為認知方面[16]，并且本研究中BBB評分結果顯示ZFTG組評分明顯優于Vehicle組，充分驗證了此濃度下ZFTG可有效促進SCI大鼠下肢主要關節(髖、膝、踝)運動功能及其協調性的恢復。由于其行為學評分在第7天開始出現明顯差異，所以，本課題應用術后第7天大鼠進行機制探究。脊髓組織中負責傳遞信號的細胞是神經元，因此，神經元的含量與功能是否正常可以影響脊髓相應節段中神經的傳導功能。因此，神經元含量可以粗略反映出神經傳導是否正常[17]。本研究結果顯示，在神經元特異性尼式染色的結果中，ZFTG組脊髓前角運動神經元的數量明顯多于Vehicle組，說明追風透骨膠囊可以增加脊髓內神經元的含量。因為脊髓前角運動神經元主要支配軀體運動，所以追風透骨膠囊可能與大鼠運動功能的恢復有密切聯系。

圖2 追風透骨膠囊對脊髓神經元含量的影響

圖3 追風透骨膠囊對炎癥反應及細胞凋亡水平的影響及其分子機制

注：A.Western blot檢測追風透骨膠囊對炎癥反應和細胞凋亡水平的影響，B.β-catenin/β-actin的定量分析，C.LRP-6/β-actin的定量分析,D.active Caspase-3/β-actin的定量分析。與Vehicle組比較，*P<0.05，**P<0.01

研究表明，神經損傷恢復過程中會出現炎癥反應、細胞凋亡、細胞自噬等病理生理反應，特別是在中樞神經系統中，神經元的凋亡水平可以直接決定相應脊髓節段神經通路是否可以正常傳導[11-14]。Wnt/β-catenin信號通路在中樞神經系統中發揮重要的抗凋亡作用，并且此通路激活后，相關的關鍵因子LRP-6也會被特異性激活[6]。本研究表明，術后第7天，ZFTG組的active Caspase-3蛋白表達水平被明顯抑制，說明追風透骨膠囊可以有效減低SCI損傷組織中細胞凋亡水平。同時本實驗結果顯示，ZFTG組β-catenin、LRP-6蛋白表達水平明顯升高，說明追風透骨膠囊通過激活Wnt/β-catenin信號通路降低細胞凋亡水平。

本研究采用追風透骨膠囊干預SCI模型大鼠，觀察大鼠運動功能的恢復及其分子機制。結果顯示，ZFTG可以增加SCI大鼠模型的脊髓前角運動神經元的數量，這可能與大鼠運動功能的恢復有關。同時，追風透骨膠囊可以明顯降低損傷脊髓中細胞凋亡水平，這可能與ZFTG激活Wnt/β-catenin信號通路有關。綜上所述，ZFTG可以抑制SCI引起的細胞凋亡，并可增加脊髓前角運動神經元的數量，進而促進廣大脊髓損傷患者損傷神經元的修復，并提高其生活質量水平。