MTHFR基因多態性與阿托伐他汀鈣治療H型高血壓療效的相關性研究

徐占領

0 引言

進入本世紀以來，隨著我國老齡化進程的加快，高血壓的發病率一直居高不下，甚至出現逐年上升的趨勢。國外有研究顯示，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)與心腦血管疾病尤其是高血壓的發生密切相關[1]。《中國高血壓防治指南2010版》中也指出，Hcy是誘發心腦血管疾病發生的新的危險因素[2]。因此，有研究者將人體血漿Hcy>10 μmol/L的高血壓患者定義為H型高血壓[3]。對于H型高血壓患者的治療，應在控制血壓的同時，強調降低其Hcy水平。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene tetrahydmfolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝過程中的一種關鍵酶，可促使5,10-MTHF轉化為 5-MTHF，參與Hcy再甲基化過程[4]。因此，當MTHFR發生遺傳缺陷時，血漿Hcy水平會異常升高。近年來，隨著醫學水平的發展，從遺傳學角度探討基因突變與高血壓發病機制的相關性已經成為心血管領域的研究熱點。有研究顯示，我國人群MTHFR基因C667T遺傳突變率較高，在環境和遺傳雙重因素的影響下，我國75%以上的高血壓患者都屬于H型高血壓[5]，因此，探討MTHFR基因C667T單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與降壓藥物療效之間的關系，對于采取個體化治療具有重要的臨床價值。阿托伐他汀鈣屬于新型羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，研究顯示，阿托伐他汀鈣可能通過降低血清Hcy濃度發揮內皮保護作用[6]。本研究旨在探討H型高血壓患者接受阿托伐他汀鈣治療后血漿Hcy的變化，及其與MTHFR C667T基因多態性的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2017年10月在我院心內科住院或門診就診的H型高血壓患者476例，其中男257例，女219例；年齡39～81歲，平均年齡(58.67±8.19)歲。采集血液樣本測定Hcy含量，所有患者Hcy≥10 μmol/L。按照隨機數字表法，將患者分為對照組(212例)和觀察組(264例)。兩組患者的年齡、性別比例、平均病程、體重指數(Body mass index，BMI)、平均收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)、平均舒張壓(Diastolic blood pressure，DBP)等一般臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本項研究已獲得我院倫理委員會批準。見表1。

1.2 受試者入選標準 ①所有患者均符合《中國高血壓防治指南2010版》關于原發性高血壓的診斷標準：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg；②所有患者遵循自愿原則，并簽署知情同意書。

1.3 受試者排除標準 ①不符合上述納入標準的受試者；②合并惡性腫瘤者；③合并器質性心臟病變者；④合并有血液系統疾病、免疫系統疾病、內分泌疾病或急性感染者；⑤合并其他嚴重疾病者；⑥受試前1個月內服用葉酸、維生素B及其他影響維生素代謝的藥物者；⑦受試前1個月服用他汀類藥物者等。

1.4 治療方案 所有患者采用常規降壓藥物治療，包括鈣離子拮抗劑、β受體阻斷劑、利尿劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、AT1受體拮抗劑等。觀察組患者在常規降壓藥物治療的基礎上加服阿托伐他汀鈣(立普妥，輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051407，10 mg/片) 20 mg/次，1次/d。連續治療12周。

1.5 研究方法

1.5.1 樣本采集 采集所有受試者清晨空腹時的外周靜脈血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二鈉(EDTA-Na)抗凝劑的采血管中，用于檢測生化指標；其余血液樣本于-70 ℃低溫保存，用于進行DNA提取。

1.5.2 血壓測量 所有患者均在每日8∶00～22∶00采用歐姆龍醫用電子血壓計測量坐位血壓，每日測量3次，取平均值。

1.5.3 生化指標檢測 由我院檢驗科采用邁瑞BS350全自動血液生化分析儀(中國邁瑞)檢測患者血糖、血脂、Hcy等生化指標。△Hcy=治療前Hcy水平-治療后Hcy水平。

1.5.4 引物設計與合成方法 根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。見表2。

1.5.5 MTHFR C677T基因多態性檢測方法 ①DNA提取：采用基因組DNA小量抽提試劑盒(由北京天根生物技術有限公司提供)。具體提取方法參照說明書進行。②采用紫外分光光度法測定DNA質量和濃度。③進行PCR-RELP：取8 μlPCR擴增產物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特異性限制性內切酶(購自大連寶生生物工程有限公司)，然后加入9 μl去離子水，于37 ℃反應12～14 h。④將PCR產物進行電泳檢測。⑤基因測序：將50 μl測序樣品送至上海生工生物工程有限公司進行純化測序；確定為目的片段后，進行大批量擴增，電泳，酶切，確定基因型。

表1 患者一般臨床資料(例)

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件，每一等位基因出現的頻率采用直接計數法進行計算；符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗進行兩組間的數據比較；計數資料以率(%)表示，數據比較采用χ2檢驗。采用Logistic多元回歸分析確定MTHFR基因多態性與Hcy水平的關系。并采用系列模型校正相關危險因素，其中以單因素回歸中P<0.05的指標為標準選擇協變量建立線性回歸模型。統計學顯著性差異檢驗均為雙側。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者生化指標比較 兩組患者總膽固醇水平、三酰甘油、空腹血糖值及Hcy水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表3。

2.2 兩組患者MTHFR C677T基因型及等位基因分布頻率比較 觀察組患者MTHFR C677T基因多態性分布頻率為21.97%CC、47.73%CT、30.30%TT，對照組為23.11%CC、46.70%CT、30.19%TT，兩組患者均以雜合型CT型為最多見；觀察組患者等位基因頻率分別為45.83% C、54.17% T，對照組為46.46% C、53.54% T，其中以等位基因T為最多見。兩組患者MTHFR C677T多態性的基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.3 不同基因型H型高血壓患者治療前后血漿Hcy水平 治療前，兩組TT型高血壓患者血漿Hcy水平高于CC型和CT型患者(P<0.05)；治療12周后，兩組3種不同基因型患者平均血漿Hcy水平均降低(P<0.05)。其中兩組TT型患者平均血漿Hcy水平仍然高于CC型和CT型患者(P<0.05)；但是觀察組TT型患者Hcy下降幅度大于CC型和CT型患者(P<0.05)；而對照組3種基因型患者Hcy下降幅度基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

2.4 MTHFR基因單倍體型與阿托伐他汀鈣對Hcy水平降低作用的相關性 經單因素Logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C677T位點突變型TT及阿托伐他汀治療是影響Hcy變化量的因素(OR=1.114，95%CI:1.068～1.372，P<0.05；OR=0.897，95%CI:0.635～0.912，P<0.05)。此外，為了排除各種因素對Hcy變化量的影響，筆者采用系列模型進行校正，包括模型1(校正了年齡、性別、病程、BMI)、模型2(校正了SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy)。最終，以單因素分析中P<0.05的變量作為協變量構建模型3。經多元Logistic回歸分析結果顯示，校正其他獨立危險因素，MTHFR C677T基因位點TT型突變和是否加服阿托伐他汀鈣對于降低H型高血壓患者血漿Hcy水平具有交互作用(P<0.05)。見表6。

表2 MTHFRC677T基因SNPs分析

表3 兩組患者生化指標比較(mmol/L)

表4 MTHFR C677T基因多態性基因型及等位基因頻率分布(例，%)

3 討論

目前，心腦血管疾病已經成為全球性問題，而高血壓是心腦血管疾病發生的重要危險因素。高血壓的發病因素復雜且多樣化，大量研究顯示，血漿Hcy水平升高是高血壓發生的獨立危險因素[7]。目前國際上將Hcy>10 μmol/L的原發性高血壓患者定義為H型高血壓。在我國，高血壓患者血漿Hcy水平普遍高于國外高血壓患者的平均水平，因此，大部分原發性高血壓患者均伴有高Hcy血癥，尤其是男性高血壓人群中，H型高血壓患者的比例甚至高達90%以上[8]，據推測可能的原因包括環境因素、飲食習慣及遺傳因素等。Hcy并非自身合成，而是主要來源于食物中攝取的蛋白質，是蛋氨酸水解過程中的中間產物，其中亞甲基四氫葉酸還原酶與Hcy代謝密切相關[9]。有研究顯示，我國人群MTHFR C677T TT基因攜帶率較高，對代謝酶的活性影響較大，血漿Hcy的整體水平相對偏高[10]。因此，有效地控制血漿Hcy水平對于降低心腦血管疾病的發生風險具有重要意義。

目前，在我國臨床上主要采取鈣離子拮抗劑、β受體阻斷劑、利尿劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、AT1受體拮抗劑等進行降壓治療，但是對于血漿Hcy水平的改善作用并不明顯。阿托伐他汀鈣是一種新型的人工合成的降壓調脂藥物，對血管內皮功能有明顯的改善作用[11]。研究顯示，阿托伐他汀鈣可降低血漿Hcy水平以及Hcy引起的氧化應激反應，從而保護血管內皮[12]。而MTHFR基因是H型高血壓疾病遺傳易感性的重要基因，其是否與阿托伐他汀鈣降低Hcy水平有密切關系是本項研究的主要目的。

表5 兩組不同基因型患者治療前后血漿Hcy水平(μmol/L)

注：*與突變型TT組比較，P<0.05

表6 經多元Logistic回歸分析MTHFR基因型與Hcy水平變化的相關性(△Hcy作為因變量)

注：模型1，校正了年齡、性別、病程、BMI；模型2，校正了SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy；模型3，校正了年齡、性別、病程、BMI、SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy

近年來，隨著分子生物學的發展，尤其是基因組計劃和后基因組計劃研究工作的深入開展，為探討高血壓個體化治療的遺傳學機制提供了新的思路和方法。1995年，由Frosst等[13]學者首次發現MTHFR C677T配體結合域存在功能性氨基酸變異現象，可影響Hcy代謝酶的活性，MTHFR C677T突變是目前發現的MTHFR基因最常見的不耐熱突變位點。有研究證實，MTHFR C677T基因CT型和TT型酶活性較CC基因型明顯降低，從而導致血漿Hcy水平升高[14-15]。基于前期報道，本項研究著重探討了MTHFR C677T基因多態性與阿托伐他汀鈣對H型高血壓患者血漿Hcy降低作用的相關性。結果顯示，治療前，TT型患者血漿Hcy水平高于CC型、CT型患者，提示H型高血壓人群中MTHFR基因677C/T純合突變TT基因型可能是Hcy升高的重要遺傳因素。H型高血壓患者接受阿托伐他汀鈣治療后，血漿Hcy水平明顯降低，尤其是TT型患者血漿Hcy水平降低最為明顯，與CC型、CT型患者血漿Hcy平均降低幅度比較，差異有統計學意義。經二元Logistic回歸分析，MTHFR C677T基因位點TT型突變是阿托伐他汀鈣降低H型高血壓患者血漿Hcy水平的重要影響因素。

由于H型高血壓發病機制復雜且與遺傳因素密切相關，不同種族、地區的人群基因背景也不甚相同，所以MTHFR C677T基因多態性與降壓藥物療效的相關性尚待進一步確證。但是本研究在一定程度上反映了阿托伐他汀鈣對于攜帶有MTHFR C677T基因位點TT型突變的H型高血壓患者的血漿Hcy水平有明顯的降低作用，從而為H型高血壓患者的個體化治療提供了一定的證據支持。