內質網應激對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

張強 徐亮

西南醫科大學附屬醫院胃腸外科（四川瀘州 646000）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤發生率的第4位，預后較差，其病死率高居世界第2位［1］。中國胃癌發病例數和死亡例數分別占全球胃癌發病和病死的42.6%和45.0%，在全球183個國家中發病率位于第5位、死亡率第6位［2］。目前公認的幽門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）感染是引起胃癌重要危險因素之一［3］。世界衛生組織國際癌癥研究機構已將HP納入第一類致癌原［4］。近年來研究發現，內質網應激在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用［5］，但具體作用機制尚不完全清楚。本文探討內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料二氧化碳孵箱購買于日本三洋公司；酶標儀購買于美國Thermo公司；電泳儀、電泳槽和轉移電泳槽購買于Bio-Rad公司；流式細胞儀購買于英國CytoFLEX公司；胃癌SGC-7901細胞是由西南醫科大學醫學實驗中心提供；培養基（RMPI 1640）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、澳洲胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；抗體蛋白免疫球蛋白結合蛋白（BiP）、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）、凋亡蛋白（Caspase-3）及內參（β-actin）購自美國Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配制試劑盒、BSA封閉液、山羊抗鼠、山羊抗兔、硝酸纖維素膜（PVDF）發光試劑盒（BeyoECL Plus）、MTT試劑盒購于碧云天生物技術公司；衣霉素（tunicamycin，TM）及4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）購于美國Sigma公司；FITC Annexin V凋亡試劑盒購買于BD公司。

1.2 細胞培養及分組細胞的完全培養基中加入濃度為10%胎牛血清和1%的雙抗，并培養于37℃、5%CO2孵箱中，每隔1～2 d換液一次，培養至細胞密度為80%左右進行傳代。根據細胞不同處理條件，將對數期生長的細胞采用隨機分組法分為3組：對照組（Control）、內質網應激組（ERS）、抑制劑組（4-PBA）。對照組采用完全培養基培養；內質網應激組給以3.5 μmol/L衣霉素處理24 h；抑制劑組給以100 nmol/L的4-苯基丁酸處理24 h。

1.3 MTT法檢測各組細胞的活性經過不同處理后的細胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，棄去液體，各瓶加入2 mL二甲基亞砜振蕩15 min。每組細胞在96孔板上均設置5個復孔，每孔分別吸取200 μL細胞懸液，用酶標儀檢測其在490 nm波長下的吸光度值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡各組處理后的細胞，用胰蛋白酶消化各組細胞2 min，溫柔吹打下細胞，使細胞懸浮，1 000 r/min（r=25 cm）離心5 min，用預冷的PBS洗滌3次，重懸細胞計數至5×106/mL，取100 μL細胞懸液于5 mL試管中，加入5 μL FITC及5 μL PI，25 ℃條件下避光孵育15 min，加入1×緩沖液400 μL，1 h內上機進行流式細胞學檢測，每組重復檢測3次。

1.5 Western blot法檢測Bip、CHOP和Caspase-3蛋白的表達量處理后的細胞，吸盡細胞培養液，用預冷的PBS液洗滌細胞3次，吸盡PBS后，每組中加入含1%PMSF酶抑制劑及1%磷酸酶抑制劑的強RIPA細胞裂解液約600 μL，于冰上裂解30 min后，用細胞刮瓷刮下細胞，并轉移至1.5 mL離心管中，超聲震蕩使細胞核破裂（5次，5 s/次），4℃離心（20 000 r/min，r=4 cm，15 min）去除沉淀后，用BCA測定蛋白濃度，配平蛋白濃度，加5×上樣緩沖液煮沸（100℃15 min），取相同質量的蛋白上樣，于SDS-PAGE凝膠電泳；轉移至PVDF，5%的BSA常溫下封閉1 h，TBST洗膜3次（每次5 min），一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，曝光顯影。利用圖像分析軟件Fusion對條帶進行灰度值定量分析，用“目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值之比”代表靶蛋白的量，重復3次實驗。

1.6 統計學方法實驗結果采用SPSS 17.0統計軟件包處理數據，所有數據采用均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準P=0.05。

2 結果

2.1 各組細胞的活性情況與對照組比較，內質網應激組胃癌SGC-7901細胞吸光度值明顯降低，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01），與抑制劑組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；而與對照組比較，抑制劑組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞的活性圖Fig.1 The proliferation of cells

2.2 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率與對照組比較，內質網應激組胃癌SGC-7901細胞凋亡率明顯增加，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01），與抑制劑組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。而與對照組比較，抑制劑組差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖2。

2.3 各組細胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白的表達量與對照組比較，內質網應激組SGC-7901細胞Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表達量上調（增加倍），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與抑制劑組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。而與對照組比較，抑制劑組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 各組細胞凋亡檢測結果Fig.2 The percentage of cell apoptosis

圖3 各組細胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表達結果Fig.3 The expression levels of Bip，CHOP and Caspase-3

3 討論

目前胃癌的主要治療方式采用以盡早的手術干預為主及輔助放化療的綜合治療，可顯著增加胃癌患者的生存率。但在我國大多數診斷的胃癌患者已為中、晚期胃癌，失去絕佳的手術機會，導致預后較差，病死率較高［6］。內質網是真核細胞的細胞器，參與重要的生理功能，如蛋白質的加工廠，多種病理生理因素可破壞內質網穩態，引發蛋白質合成障礙，而錯誤折疊和未折疊的蛋白質在內質網腔內堆積，細胞為此將做出一系列的應激反應，即發生ERS反應［7］，若ERS反應較重，則凋亡信號通路會被激活，引起細胞凋亡。

內質網應激在許多腫瘤細胞中普遍存在［8］；BIP是一種分子伴侶，是由內質網合成及分泌的蛋白，正常情況下分泌較少，當發生內質網應激時，大量分泌，BIP高表達常被用作檢測ERS存在的標準［9］。BIP可識別錯誤折疊蛋白，協助蛋白質的折疊、組裝、延伸和轉運、幫助未折疊蛋白質位于內質網腔，防止未折疊或錯誤折疊蛋白質的輸出，保護細胞［10］。近年研究發現［11］，內質網應激可能在腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移中均發揮重要作用。人體胃癌組織中，內質網陪伴分子GRP78和GRP79高表達，且與腫瘤大小、侵襲深度和淋巴結轉移等相關［12］。CHOP是內質網應激另一個特異轉錄性因子，屬C/EBP轉錄因子家族成員，當ERS時，CHOP的表達量大大增加并聚集在細胞核內，CHOP過量表達能使細胞凋亡；CHOP還可影響Bcl-2家族蛋白的表達，能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達［13］，提高線粒體對促凋亡因素的敏感性。Caspase蛋白屬半胱天冬酶家族，是ERS凋亡途徑中特異性凋亡介質，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化，只能被ERS激活并能介導線粒體非依賴性的細胞凋亡［14-15］。

本研究發現，SGC-7901細胞經過3.5 μmol/L濃度的衣霉素處理24 h后，與對照組比較，MTT實驗示細胞的吸光度值（OD值）降低；流式細胞學示細胞的凋亡率增加；Western blot法示BiP、CHOP和Caspase-3蛋白的表達明顯上調；而與對照組比較，內質網抑制劑組無明顯變化；揭示了衣霉素誘導SGC-7901細胞發生內質網應激，經過內質網應激后可引起細胞凋亡。通過內質網應激可使腫瘤細胞呈程序性的死亡，抑制腫瘤的發生發展，可對腫瘤的治療和預防在內質網應激層面提出新思路。

綜上所述，衣霉素可誘導胃癌SGC-7901細胞內質網應激并上調Caspase-3蛋白表達水平，引起胃癌細胞凋亡；然而，參與內質網應激過程的機制十分復雜，有待于進一步研究。