microRNAs調控胃癌相關基因的研究進展

路玉盼,董憲喆,王 瑾,劉 屏

(1. 中國人民解放軍總醫院臨床藥理研究室,北京 100853；2. 山西中醫學院中藥學院,山西 晉中 030600)

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在東亞尤其高發，據世界衛生組織統計，東亞胃癌發病率和死亡率分別位居世界第2和第3，其中中國占有較大的比例。我國胃癌的死亡率超過世界平均水平的兩倍，其高死亡率主要是由于早期診斷困難和缺乏有效的干預手段，將近2/3胃癌患者確診時已處于晚期，并伴有瘤轉移，提高胃癌的診療水平，是臨床研究者所面臨的重大挑戰[1-2]。迄今為止，胃癌的發病機制仍不明確，但大量研究表明，其發生和侵襲轉移是一個多基因及相關分子共同參與的過程，涉及多種相關癌基因、抑癌基因、信號通路的關鍵蛋白等。目前，研究較為明確的胃癌相關基因主要有表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)、PTEN、人類端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT)、Bcl-2、c-myc等。

微小RNAs (microRNAs，miRNAs) 是一類內源性非編碼單鏈RNAs，可與靶mRNA 3’-非翻譯區(3’-untranslated regions，3’-UTR)互補配對，導致mRNA 降解或抑制其翻譯，發揮調控基因表達的作用。miRNAs可通過調控細胞增殖、分化、存活、代謝、基因組穩定性、炎癥、侵襲等生理過程，影響腫瘤的發展。 在關于人類癌癥的報道中，其表達水平經常是失調的，扮演著癌基因或抑癌基因的角色[3]。在惡性轉移性腫瘤中，miRNAs的表達普遍下調，使腫瘤細胞轉移和侵襲相關的趨化因子、受體等蛋白的表達升高、功能增強，促進了腫瘤的發生發展[4]。miRNAs有望單獨或聯合作為腫瘤的診斷標志物和治療靶點[5]，為尋找更有效的腫瘤診治手段提供了全新視角?，F將近年miRNAs通過調控與胃癌相關基因及蛋白Her-2、PTEN等的表達，參與胃癌發生發展的進展進行綜述，旨在為進一步尋找胃癌更為特異、靈敏的診斷標志物和治療靶點，奠定理論基礎。

1 miRNAs對胃癌相關基因及蛋白的調控作用

1.1miRNAs對Her-2的調控作用Her-2基因是原癌基因，可編碼酪氨酸激酶受體，Her-2的活化可誘導胃癌細胞浸潤性生長，促進細胞增殖、分化、轉移、侵襲、血管再生等，在胃癌的發生、發展中起關鍵作用。EGF/Her-2軸在包括胃癌在內的多種腫瘤中均處于激活狀態，與侵襲性表型和預后不良息息相關[6]。

Liu等[6]發現，胃癌組織中miR-133水平的下調會促進癌細胞生長，進一步機制研究，在人胃癌細胞AGS 的Her-2基因3’-UTR植入熒光素酶報告基因質粒，然后通過轉染miR-133的模擬物和反義寡核苷酸，觀察miR-133對Her-2表達的影響，結果顯示：miR-133模擬物可降低Her-2基因表達，而miR-133反義寡核苷酸可升高細胞內Her-2基因水平；同時，過表達miR-133可抑制細胞增殖、促進凋亡，抑制miR-133表達可促進細胞生長、抑制凋亡，說明Her-2基因是miR-133的靶基因。其他學者采用類似的方法，發現Her-2高表達、miR-331-3p低表達與晚期胃癌緊密相關，高水平HOTAIR通過結合 miR-331-3p 3’-UTR，間接解除了miR-331-3p對Her-2的抑制作用，參與了胃癌的發生發展[7]。Fassan等[8]在涵蓋了胃癌和食道腺癌完整組織學譜的90例活檢樣本中，發現miR-125a-5p和 miR-125b明顯低表達，Her-2的表達與miR-125表達呈負相關。PCR實驗進一步證實，Her-2低表達和Her-2高表達的胃癌和食道腺癌樣本中，miR-125a-5p和miR-125b仍與Her-2的表達呈明顯負相關，與前述結果一致。說明miR-125a-5p和miR-125b可調控Her-2的表達，Her-2為miR-125的靶基因。miRNAs通過調控癌基因Her-2的表達，參與了胃癌進展，提示我們可以通過檢測相應miRNAs水平或調整其水平，為胃癌診斷和治療提供參考依據。上述研究雖顯示在腫瘤形成級聯反應中，癌基因Her-2表達是失調的，但導致Her-2蛋白上調的機制仍不清楚，需要更多的深入研究[8]。

1.2miRNAs對PTEN的調控作用定位于人類染色體10q23的PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，能夠抑制腫瘤細胞增殖、轉移和浸潤，還可通過調控相關信號通路，參與血管生成，該基因的突變失活與人類多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關。近期研究表明，PTEN在人類胃癌中是低表達或不表達的，其低表達能夠使胃癌患者對多種化療藥物產生抗性[9-10]。

miR-214被發現在胃癌組織和細胞株中過表達，且miR-214的表達水平與胃癌的進展以及預后不良緊密相關。同時，在腫瘤組織中，miR-214水平和PTEN的表達呈明顯負相關，即miR-214通過靶向PTEN基因的3’-UTR，在轉錄后水平負向調控PTEN的表達。PTEN與癌細胞的轉移和浸潤等密切相關，所以推測miR-214可通過抑制PTEN的表達，參與胃癌的發生、發展[9]。依賴于炎癥因子IL-1β激活的核因子NF-κB，可以促進miR-425的上調，上調的miR-425再通過靶向PTEN，來促進胃癌細胞的生長[11]。Shi等[12]在胃癌細胞和腫瘤樣本中發現，miR-221-3p明顯高表達，進一步機制研究揭示，miR-221-3p可能是通過抑制靶基因PTEN的表達，發揮致瘤特性。

Wang等[10]對miR-19a/b在耐藥胃癌細胞株中的作用機制進行了研究，發現miR-19a/b表達的上調，可降低胃癌細胞對化療藥物阿霉素的敏感性。機制研究發現，miR-19a/b除了可以通過上調MDR1和P-gp蛋白的水平，加速胃癌細胞中阿霉素的主動外排，同時可通過調控Bcl-2和Bax的表達，來拮抗藥物誘導的細胞凋亡作用。Western blot結果顯示，在轉染miR-19a/b的SGC-7901細胞中，PTEN表達下調，Akt表達上升，提示miR-19a/b可通過調節PTEN-Akt信號通路，增加藥物的排出，降低細胞對藥物的敏感性。研究最終證實了PTEN是miR-19a/b功能性的靶標，miR-19a/b可抑制PTEN的表達，參與胃癌多藥耐藥性的形成。此外，還有其他研究發現多個miRNAs可通過直接靶向PTEN，調控PTEN的表達，在胃癌耐藥等方面發揮重要作用。如Yang等[13]證實了miR-21通過調控PTEN的表達，使胃癌患者對順鉑治療抗性增強。因此，PTEN 基因的生物治療將會為耐藥的腫瘤患者帶來福音，可能為腫瘤的治療提供新的途徑。

1.3miRNAs對hTERT的調控作用hTERT決定了端粒酶的活性，能夠逆轉端粒縮短。當正常增殖的細胞進入凋亡和壞死階段時，hTERT表達會逐漸降低，此時細胞停止增殖。然而，高表達的hTERT以及端粒酶的激活都會導致腫瘤細胞無限增殖。hTERT在腫瘤形成、癌細胞生長、轉移和浸潤方面發揮了重要作用[14]。

Zhang等[15]發現，miR-1182通過結合hTERT基因的開放閱讀框，調控hTERT的表達，進而抑制了胃癌細胞的增殖和轉移。尚有miR-1207-5p 和 miR-1266通過直接結合于靶基因hTERT 3’-UTR,抑制了胃癌細胞的生長和浸潤的相關研究[14]。競爭性內源RNAs(competing endogenous RNAs，ceRNAs)是一種全新的基因表達調控模式，是RNAs的一種作用方式。細胞內存在一類內源性RNAs，由于3’-UTR含有與miRNA靶mRNA 3’-UTR相似的miRNAs反應原件(miRNAs response elements，MREs)，可以競爭性結合相同的miRNAs，進而調節各自的表達水平[1]。Lü等[16]近期研究結果表明，長鏈非編碼RNA BC032469作為競爭性內源RNA，競爭結合miR-1207-5p，從而消除了miR-1207-5p對靶基因hTERT的抑制作用，促進了胃癌細胞增殖。

1.4miRNAs對Bcl-2的調控作用Bcl-2家族蛋白是一類凋亡進程的重要調節因子，可調控細胞色素C釋放及caspases級聯反應，最終影響凋亡發生。Bcl-2蛋白作為細胞凋亡的抑制基因，在caspases級聯放大與線粒體之間扮演著“橋梁”的作用。在多種人源腫瘤細胞株中可觀察到 Bcl-2過表達，而在分化細胞或將凋亡細胞中表達量很低或不表達。

Zhu等[17]研究了胃癌樣本中miR-429和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，并分析了二者表達水平的相關性。結果顯示，與癌旁組織相比，miR-429水平在胃癌樣本中明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，兩者呈明顯的負相關，進一步的熒光素酶報告基因法顯示，miR-429調控了Bcl-2的表達。此外，下調miR-429可阻斷5-氟尿嘧啶(5-FU)處理導致的胃癌細胞AGS活力下降和凋亡增加，而上調miR-429可與5-FU的抗腫瘤作用產生協同效應。由此我們推測，過表達miR-429可作為胃癌的潛在治療靶標，通過增加其表達可輔助化療藥物誘導細胞凋亡。有研究報道[18]，miR-449a 通過抑制靶基因Bcl-2的表達，促進人類胃癌細胞株MGC-803和SGC-7901凋亡。

Sacconi等[19]發現，miR-204在胃癌和癌旁組織樣本中表達水平存在明顯差異，進一步研究發現，miR-204靶向抑制Bcl-2 mRNA的表達，可以增強胃癌細胞對順鉑和奧沙利鉑等抗癌藥物的反應性；miR-204異位表達可抑制細胞集落形成、遷移和浸潤。最新研究顯示[20]，胃癌細胞SGC-7901中，miR-449a表達水平明顯低于正常的胃上皮細胞GES-1，同樣，miR-449a在胃癌組織中的表達也明顯低于癌旁組織。MTT實驗結果表明，上調miR-449a水平抑制了SGC-7901細胞的增殖；流式細胞術檢測發現，miR-449a異位表達可降低S期細胞百分率，同時增加G1/G0期細胞比率，并與順鉑誘導的胃癌細胞凋亡作用相協同；進一步的機制研究表明，miR-449a可能是通過抑制Bcl-2和cyclin D1表達，在胃癌中發揮抑癌作用，同時增強胃癌對化療的敏感性。miRNAs對癌基因Bcl-2表達的抑制作用，提示我們可以從調節miRNAs表達角度來考慮對胃癌的防治策略。除上述miRNAs之外，Bcl-2還可以受到miR-190b等多種miRNAs的轉錄后調控，影響細胞凋亡，在胃癌細胞化療抗性形成過程中發揮重要作用。

1.5miRNAs對c-myc的調控作用c-myc作為一種癌基因，廣泛參與了細胞遷移、生長、增殖等多個生理過程，在人類多種腫瘤中過表達。最新研究顯示，c-myc在胃癌進展中發揮著促癌作用，其過表達與胃癌晚期、淋巴結轉移、低存活率緊密相關[21]。

miR-155被發現在胃癌組織和胃癌細胞株SGC-7901中明顯低表達，而高水平的miR-155可明顯抑制腫瘤細胞的活力、增殖以及黏附。進一步研究顯示，miR-155可通過直接結合c-myc基因的3’-UTR，抑制其表達，在胃癌進程中發揮一定作用[22]。Qian等[21]采用生物信息學分析手段，預測c-myc可能是miR-561的靶基因，采用熒光素酶報告基因法進一步驗證，結果顯示miR-561通過直接結合c-myc 3’-UTR，抑制其表達；恢復c-myc在胃癌細胞中的表達，會扭轉miR-561對其表達的抑制作用。miR-561通過抑制靶標c-myc的表達，抑制了胃癌細胞的增殖和浸潤，說明miR-561有作為腫瘤抑制因子的潛質。基因上游CpG島高甲基化常常導致抑癌miRNAs下調，Yin等[23]在miR-33b低表達的胃癌細胞中，采用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)，發現miR-33b基因上游的CpG島甲基化水平有所升高。進一步通過轉染、免疫印跡等方法發現，抑癌miR-33b和c-myc在胃癌細胞和樣本中表達呈負相關，研究結果表明miR-33b可能是通過靶標c-myc的表達，抑制了腫瘤的轉移、浸潤和增殖。研究表明[2]，let-7b也可通過下調c-myc，增強順鉑和長春新堿耐藥的SGC-7901對化療藥物的敏感性。

1.6其他除了前述公認的參與胃癌發生發展進程基因外，miRNAs還可通過調控其他基因的表達，參與胃癌發生、發展以及腫瘤對化療藥物的多藥耐藥。miR-139通過調控靶基因C-X-C 趨化因子受體4(CXCR4)的表達，參與Her-2信號通路，促進胃癌進展和轉移[4]。在研究miR-219-2-3p對胃癌抑癌機制時，金錦蓮等[24]發現，胃癌細胞株中miR-219-2-3p可能是通過下調ERK信號通路的活性，從而產生對胃癌細胞的抑制作用。膜受體配體JAG1在多種腫瘤中高表達，且與預后存活率低密切相關。韋尉元等[25]在預測 miR-1284可能的下游靶基因的基礎上，進一步探討了miR-1284與胃癌的相關性及分子機制，結果顯示，miR-1284可能通過調控靶基因 JAG1，發揮抑制胃癌發生、發展的作用。

2 小結

雖然近年來胃癌診斷方法和外科治療技術不斷提高，但晚期胃癌患者的預后仍不理想。因此，探尋特異、靈敏的生物學標志物，盡早明確診斷和選擇治療方式，對于提高胃癌患者的生存率具有重要意義。近期研究較熱的非編碼miRNAs在許多疾病和癌癥中表達失調，失調的miRNAs會影響大多數的癌癥特征，具體了解miRNAs是如何影響癌癥相關生物過程，其定量分析會對癌癥的診斷、治療和預后有很大參考價值。未來能將miRNAs用于胃癌診斷標志物和治療靶點不失為一個好方向。

目前對miRNAs作為診斷標志物的研究尚處于探索階段，所檢測到的病例數有限，文中提及可能參與胃癌發生機制的miRNAs(Fig 1)指標是否是胃癌所特異的？尤其在不同分期胃癌患者體內表達，是否具有臨床參考價值？這些問題的解決尚需投入更多的臨床研究。目前，已有關于多個miRNAs聯合起來組成的miRNAs循環分子標記物表達譜在結腸癌診斷方面的研究[4]。相信隨著對miRNAs 研究不斷深入，miRNAs單獨或聯合作為腫瘤診治評估的重要指標，在未來有望應用于臨床。

Fig 1 Mechanism of miRNAs regulating expression of gastric cancer related genes