葉酸修飾氧化石墨烯裝載松針木栓酮聯(lián)合微波釋藥的抗腫瘤研究

李啟照，錢溪溪，陶方紅

(安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088)

胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，目前主要是通過手術(shù)治療切除病灶部位或化療放療進行醫(yī)治，對人體傷害極大.研究表明，植物活性成分黃酮類化合物可通過抗氧化、激素調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進腫瘤細胞分化和凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，療效確切[1].雪松是松科雪松屬植物的總稱，具有活血消腫、祛風活絡(luò)、抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效[2].葉酸修飾的氧化石墨烯是一種很有前途的靶向抗癌藥物載體[3].而微波釋藥則廣泛應(yīng)用于腫瘤細胞抑制的輔助治療.本實驗是利用氧化石墨烯葉酸組裝松針木醛酮進行SGC-7901抑制胃癌細胞增殖的實驗研究，目的是為松針活性成分的抗胃癌作用研究提供研究參考.

1 材料與方法

1.1 材料

雪松(Cedrusdeodara)松針采自中國安徽省大別山金寨縣；天然鱗片石墨粉(粒徑約為40～50 μm)，純度99.9%，青島歐爾石墨有限公司；葉酸，氮-羥基琥珀酰亞胺，sigma；1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，Aldrich；透析袋，寬度34 mm，容量3.4 mL/cm，截留分子量8 000～14 000，國藥集團化學試劑有限公司；胃癌細胞系SGC-7901，安徽醫(yī)科大學；RPMI-1640 培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，上海尚寶生物科技有限公司；MTT試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

水平搖床，北京六一儀器有限公司；電子天平，上海精密科學儀器有限公司；sigma超速冷凍離心機，德國sigma公司；85-2A 控溫恒速攪拌器，上海德洋意邦儀器有限公司；JY98-III 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；PS-100A 超聲波清洗器，昆山超聲波清洗器有限公司；美國Agilent 6890N氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；酶標儀(BXS01-ELx-800)，美國寶特酶標儀；VG Auto-Spec-3000質(zhì)譜儀，英國Micromass公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 松針木栓酮的制備與純化

雪松松針干燥粉末(約2.5 kg)用95%乙醇(4×8 L)提取，減壓濃縮至無乙醇氣味，加水懸浮，分別用石油醚(3×4 L)、氯仿(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)和正丁醇(3×4 L)依次萃取，減壓濃縮得浸膏,其中,石油醚部分42.0 g、氯仿部分39.0 g、乙酸乙酯部分85.0 g，正丁醇部分187.0 g.

乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱色譜，得6個部分(Fr.1～Fr.6).Fr.5經(jīng)減壓濃縮得到黑色浸膏，反復硅膠色譜(氯仿：甲醇為9：1～5：5，v/v)，用Sephadex LH-20凝膠柱(氯仿：甲醇為1：1，v/v)純化，得到木栓酮18.7 mg.

1.3.2 氧化石墨烯(GO)的制備與純化

氧化石墨烯采用Hummers制備：移取200 mL濃硫酸，在冰浴條件下放置一段時間，使其溫度接近冰浴溫度.在不斷攪拌的條件下將5 g石墨粉加入到濃硫酸中，再稱取18 g高錳酸鉀加入到濃硫酸里，保持冰浴條件下攪拌3 h，使之混勻.從冰浴中取出反應(yīng)液，并在室溫條件下繼續(xù)攪拌5 d，回到冰浴條件下，然后加入18 g高錳酸鉀，持續(xù)攪拌3 h重復上述步驟一次.量取46 mL水，逐滴緩慢加入，使混合物保持較低溫度，然后將其放在90～100 ℃水浴中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，從熱水浴中取出后加入140 mL水和30%(質(zhì)量分數(shù))的雙氧水，待變?yōu)榱咙S色后，混勻離心分離，最后分別使用無水乙醇和質(zhì)量分數(shù)為5%鹽酸對離心產(chǎn)物進行離心清洗至中性，在恒溫干燥箱50 ℃下烘干即得到氧化石墨烯.

取適量干燥后的氧化石墨烯，加入50 mL蒸餾水，在冰浴條件下，使用超聲粉碎機在500 W的功率下對混合物進行超聲震蕩1 h，獲得棕黃色的分散液，將分散液在12 000 r/min下離心15 min，收集棕黃色上清液，將沉淀再次加入到蒸餾水中，重復上述步驟，最終得到氧化石墨烯水溶液.

在氧化石墨烯的水溶液中加入適量蒸餾水，再用截留分子量為8 000～14 000的透析袋透析2 d，獲得的濾液即為氧化石墨烯的分散液.

1.3.3 葉酸修飾氧化石墨烯制備

向氧化石墨烯分散液中依次加入5 g NaOH，5 g NaClO，超聲處理2 h.待反應(yīng)完全后用稀鹽酸對溶液進行重復漂洗，漂洗完成后，將反應(yīng)液分離，在8 000 r/min的條件下離心20 min，去除沉淀，獲得上層黑色溶液.將收集到的黑色溶液用蒸餾水透析48 h，去除未反應(yīng)的物質(zhì).

向透析液中加入0.5 g葉酸，超聲處理使其均勻分散.在攪拌條件下加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和氮-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，超聲處理2.5 h后使用NaHCO3溶液(pH=8)對混合液進行透析處理48 h，每4 h更換一次NaHCO3溶液，將得到的黑色溶液使用旋蒸儀去除其中的水分，使用丙酮對黑色沉淀進行反復洗滌，于40 ℃下真空干燥，得到氧化石墨烯葉酸修飾物，記為FA/GO.

1.3.4 松針黃酮(PNF)對FA/GO的負載實驗

將0.05 g FA/GO加入到50 mL乙醇中，超聲0.5 h使其分散，然后向分散液中緩慢滴入1 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的松針木栓酮，避光攪拌24 h，待反應(yīng)完全后將燒杯中的合成液在12 000 r/min條件下離心1.5 h，去除沉淀物，可得負載了松針木栓酮的FA/GO分散液，記為FA/GO/PNC，利用氣相色譜法可計算出負載在分散液上的松針木栓酮的量.計算公式為

FA/GO/PNC上的松針木栓酮量=初始加入的松針木栓酮含量—上層清液中松針木栓酮含量，

式中：上層清液中的松針木栓酮含量可通過氣相色譜法測量離心后上層清液480 nm，然后對照繪制的松針木栓酮標準濃度曲線后計算所得.離心后下層物質(zhì)在恒定溫度為30 ℃的真空干燥箱中干燥12 h.

1.3.5 FA/GO/PNC中松針木栓酮的緩釋實驗

取干燥后的FA/GO/PNC作為樣品加入到乙醇中，混合后裝入透析袋中，扎緊，移入1 000 mL錐形瓶，加入300 mL乙醇于錐形瓶中，置于恒溫超聲儀中，保溫37 ℃.利用微波輻射儀對錐形瓶中的藥物進行輻射，設(shè)置微波功率為20～200 W，輻射時間為30～300 s,每隔30 s取1 mL透析袋外的乙醇，并加入1 mL乙醇，以保證瓶中乙醇總體積不變.氣相色譜法檢測其濃度.另一組不給予微波輻射儀處理.繪制松針木栓酮濃度-峰面積曲線，并根據(jù)這個曲線獨處ti時刻取出的乙醇中的木栓酮濃度Cti，按照下列公式計算出松針木栓酮的累積釋放率(S%).

S%=(CtiVti+∑CtiVti)/(C0V0-C1V1)×100，

其中：S%表示釋放量，V表示乙醇的體積，C0表示初始加入的松針木栓酮的濃度，V0表示初始加入的松針木栓酮的體積，C1表示載藥后經(jīng)離心所得的上清液中藥物濃度，V1表示載藥后經(jīng)離心所得的上清液體積，Ct表示t時刻取出的乙醇中藥物的濃度，Vt表示t時刻取出的乙醇的體積.

1.3.6 FA/GO/PNC與FA/GO對胃癌細胞的體外抑制實驗

胃癌細胞SGC-7901接種于完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng).取對數(shù)生長期的胃癌細胞SGC-7901制備細胞懸液，每孔5 000個細胞接種于 96 孔板中，每孔加入 100 μL完全培養(yǎng)液待24 h細胞貼壁后吸盡完全培養(yǎng)液.空白組組加入完全培養(yǎng)液，陰性組分別加入濃度為.0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO完全培養(yǎng)液，實驗組分別加入濃度為 0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO/PNC完全培養(yǎng)液，每個處理組均設(shè)5個復孔，微波處理條件下分別置于培養(yǎng)箱24h后，每孔加MTT溶液(5 μg/mL用PBS配制，pH=7.4)20 μL.孵育4 h終止培養(yǎng)，輕輕吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液.每培養(yǎng)孔內(nèi)加入150 μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解.酶標儀測定570 nm 波長處的吸光值(OD) .實驗重復 3 次.按以下公式計算FA/GO/PNC對胃癌細胞的抑制率.

細胞增殖抑制率(%)=(對照組OD-陰性組OD)/對照組OD×100.

1.3.7 Western blot法

根據(jù)MTT法結(jié)果，分別使用2 μg/mL FA/GO/PNC、FA/GO和完全培養(yǎng)基聯(lián)合微波處理胃癌細胞SGC-7901 48 h，提取蛋白質(zhì)后采用BCA法測定其總蛋白含量.分別取各組40 μg總蛋白上樣，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入適量Bax(1:1 000)、β-actin(1：2 000)、Akt(1：1 000)或p-Akt(1：1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1：4 000)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h，采用ECL發(fā)光液發(fā)光，X線片壓片、顯影、定影.采用Gel-Pro analyzer分析各顯影條帶的 A值(p-Akt與Akt的A值比值，Bax與β-actin的A值比值).

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 松針木栓酮結(jié)構(gòu)式

白色固體(乙醇)；ESI-MS正離子模式下給出準分子離子峰m/z：428 [M + H]+，450 [M + Na]+，其相對分子質(zhì)量為427.結(jié)合其NMR數(shù)據(jù)，推斷分子式為C30H50O，1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：1.97 (1H，m，H-1a)，1.70 (1H，m，H-1b)，2.38 (1H，dd，J=13.3，4.8 Hz，H-2a)，2.32 (1H，dd，J=13.1，7.3 Hz，H-2b)，2.23 (1H，d，J=6.3 Hz，H-4)，1.75 (1H，m，H-6)，0.87 (3H，s，H-23)，0.76 (3H，s，H-24)，0.88 (3H，s，H-25)，0.99 (3H，s，H-26)，1.00 (3H，s，H-27)，1.14 (3H，s，H-28)，1.03 (3H，s，H-29)，0.97 (3H，s，H-30)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz).以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道對照基本一致，故鑒定為木栓酮，見圖1.

2.2 FA/GO對松針木栓酮的負載實驗

將松針木栓酮作為藥物模型分析松針木栓酮在FA/GO上的負載效果，結(jié)果表明，F(xiàn)A/GO對松針木栓酮的負載率為67.2%，即每0.05 g FA/GO可負載1.34 g松針木栓酮.FA/GO與未經(jīng)修飾的氧化石墨烯相比，載藥率相差較小.

2.3 FA/GO/PNC的藥物緩釋研究

FA/GO上負載的松針木栓酮在微波處理條件下對其藥物釋放過程進行觀察，如圖2所示.在160 h內(nèi)藥物的釋放率呈遞增趨勢，具有較好的緩釋性.當釋放160 h時，在微波處理條件下，藥物的累積釋放率為45.68%；而當不用微波處理時，藥物的累積釋放率為33.46%.并且在40～160 h內(nèi)，在微波處理條件下藥物的釋放率較高.

2.4 FA/GO/PNC與FA/GO對胃癌細胞的體外抑制實驗

采用胃癌細胞系SGC-7901作為模型，對FA/GO/PNC和FA/GO對胃癌細胞的抑制率進行了研究，見圖3.結(jié)果表明當FA/GO/PNC濃度為8 μg/mL時，對胃癌細胞系SGC-7901的抑制率達到86.12%.而且當FA/GO濃度為8 μg/mL時，抑制率為30.85%，眾所周知，微波對癌細胞具有一定的抑制作用，故證明FA/GO作為藥物載體具有一定的安全性.

圖2 微波處理和無微波處理下的藥物釋放曲線

圖3 FA/GO/PNC與FA/GO對胃癌細胞的抑制率

2.5 FA/GO/PNC對bax蛋白及PI3K/Akt信號通路的影響

Western結(jié)果顯示:當使用2 μg/mL FA/GO/PNC聯(lián)合微波處理胃癌細胞系SGC-7901 48 h后,Bax蛋白表達比值明顯上升，而P-Akt/Akt比值明顯下降，F(xiàn)A/GO組與空白組Bax蛋白表達比值和P-Akt/Akt比值均無明顯差異.

3 結(jié)論

采用葉酸修飾氧化石墨烯后裝載松針木栓酮，聯(lián)合微波釋藥法利用MTT法，以胃癌細胞SGC-7901為模型，考察了一種新型的以氧化石墨烯為基礎(chǔ)的藥物載體(FA/GO)的載藥能力、在于微波聯(lián)用下緩釋能力、對癌細胞的抑制率，以及對PI3k/Akt信號通路的影響，獲得了較好結(jié)果，該材料對松針木栓酮的載藥率為67.2%，具有較好的應(yīng)用前景.在運用微波聯(lián)合處理時發(fā)現(xiàn)，微波對該載體系統(tǒng)釋藥具有較強作用，可對胃癌細胞起到一定的直接抑制作用.

實驗采用FA/GO/PNC聯(lián)合微波處理胃癌細胞系SGC-7901后，P-Akt/Akt蛋白比例明顯下降，提示松針木栓酮可能通過抑制PI3k/Akt信號通路，從而抑制胃癌細胞增殖.松針作為藥材研究并不多，而木栓酮這一類氧化環(huán)烷烴類化合物因為其溶解性較差，故其抗癌效果的研究也較少.該實驗通過構(gòu)建GA/GO/PNC，既解決了松針木栓酮溶解性較差的問題，又通過聯(lián)合微波局部照射，做到了藥物地靶向釋放，為傳統(tǒng)藥物化合物的提取及制劑提供了新的研究思路.