3種microRNAs在良性前列腺增生與前列腺癌組織中的表達及臨床意義

單 剛 孫兆林 劉 軍 羅光恒 石 華 胡建新 朱建國

(貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽 550002)

前列腺癌(PCa)的發(fā)病率和死亡率居我國男性惡性腫瘤第二位，早期局限性PCa根治性切除是改善預后的重要方法，血清特異性抗原(PSA)在早期篩查、診斷和隨訪中有重要應(yīng)用價值，但仍有10%～30%患者PSA始終陰性〔1〕。腫瘤的侵襲性生長是預后較差的根本原因。細胞分子生物學特征研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，各種調(diào)控腫瘤生長、增殖、遷移、分化和凋亡的基因表達異常是重要因素。微小RNA(microRNA)在真核生物體內(nèi)調(diào)節(jié)約1/3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，影響蛋白的表達、細胞信號通路的激活等〔3〕。趙琳等〔4〕研究指出，microRNA-4286在PCa患者血清中呈高表達，可作為新型液體活檢標志物。曾祥建等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-193a-3p在PCa患者組織和血液中表達下降，可能是PCa的潛在抑制因子。劉偉等〔6〕研究證實，microRNA-27b在PCa患者組織中表達明顯低于良性前列腺增生(BPH)。本研究進一步綜合分析上述3種microRNAs分子在BPH與PCa組織中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年6月至2017年6月貴州省人民醫(yī)院診斷PCa患者50例，BPH患者50例，納入標準：未行手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌等治療；手術(shù)切除或活檢取得病灶組織；臨床資料完善，取得知情同意權(quán)。排除標準：前列腺轉(zhuǎn)移癌，合并其他原發(fā)腫瘤；存在其他影響該研究結(jié)果的因素等。PCa患者年齡43～72歲，平均(55.6±12.3)歲；血PSA水平10～40 ng/ml，平均(25.8±11.2)ng/ml；病理分型腺癌40例，腺鱗癌7例，尿路上皮癌3例；Gleason評分2～4分(高分化)10例，5～7分(中分化)25例，8～10分(低分化)15例；臨床分期Ⅰ期5例，Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例；腫瘤最大直徑0.5～3.6 cm，平均(2.2±0.9)cm。BPH患者年齡45～70歲，平均(54.8±13.2)歲。兩組一般資料具有可比性(P>0.05)。

1.2研究方法 采用反轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)檢測組織中microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子表達水平，并分析其與PCa臨床特征的關(guān)系。RT-PCR法：常規(guī)Trizol試劑提取細胞中總RNA，紫外分光光度計(美國Sigma公司)測定濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Santa Cruz 公司)合成cDNA，上海生工有限公司根據(jù)Gene Bank序列合成引物序列，microRNA-4286：正義5′-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′，反義5′-ACAA AGATGGTCACGGTCTGCC-3′； microRNA-193a-3p：正義5′-ACTACTTCTCCCGCCGCTAC-3′，反義5′-GAAATCAAACAGAGGCCGCATG-3′; microRNA-27b：正義5′-TACCAGTGGAGGCCGACTTC-3′，反義5′-GCACAAAG CGACTGGATGAAC-3′；內(nèi)參U6：正義5′-CGCGAGAA GATGACCCAGAT-3′，反義：5′-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′。反應(yīng)體系為cDNA 2 μl+上下引物各3 μl+Taq聚合酶0.5 μl+dNTPs 1 μl+MgCl23 μl+10×緩沖液5 μl+ddH2O22.5 μl，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s，共30個循環(huán)，72℃ 10 min結(jié)束。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，凝膠成像分析系統(tǒng)紫外分光成像，數(shù)碼照相行灰度值分析，結(jié)果以2-ΔΔCt法表示。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.13種microRNAs分子在BPH與PCa組織中的表達 microRNA-4286在PCa組織中明顯高于BPH，而microRNA-193a-3p和-27b表達則明顯降低(P<0.001)。見表1。

2.23種microRNAs分子在PCa組織中表達與腫瘤臨床特征的關(guān)系 microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子在PCa組織中表達與腫瘤臨床分期和Gleason評分密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、血PSA水平、病理分型和腫瘤最大直徑無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1 3種microRNAs分子在BPH與PCa組織中的表達

表2 3種microRNAs分子在PCa組織中表達與腫瘤臨床特征的關(guān)系

與Gleason評分<8分比較:1)P<0.05；與臨床分期Ⅰ～Ⅱ比較：2)P<0.05

3 討 論

MicroRNAs雖有眾多，但具備共同的分子生物學特征，框架結(jié)構(gòu)有相似性，都沒有開放閱讀框架，可以在所有真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)，且不能編碼蛋白質(zhì)，長度相似，大小為18～22 nt，是短序列小分子RNA〔7〕。microRNA是重要的調(diào)控因子，參與細胞生長、增殖、分化、代謝及凋亡、新生血管生成、細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等行為〔8〕。本文提示，microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子可作為診斷PCa的重要分子標志物。microRNA-4286基因定位于人染色體8p23.1上，堿基序列為5′-ACCCCACUCCUGGUACC-3′。 研究顯示 microRNA-4286 在黑素瘤和食管癌中高表達，與疾病預后密切相關(guān)〔9〕。microRNA-193a-3p序列為5′-AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU-3′，主要通過抑制細胞周期發(fā)揮抑癌作用。Liang等〔10〕研究證實，microRNA-193a-3p在肺癌中低表達。microRNA-27b基因定位于人染色體9q22.32上，研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，其在乳腺癌和膠質(zhì)瘤中呈高表達，而在結(jié)直腸癌低表達。體外研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，表皮細胞生長因子和腫瘤壞死因子(TNF)-α能通過蛋白激酶B(AKT)/核因子(NF)-κB信號通路上調(diào)microRNA-27b表達。本研究結(jié)果不僅提示上述3種microRNAs可作為鑒別PCa的重要分子標志物，且臨床分期越早，分化程度越高，microRNA-4286水平越低，microRNA-193a-3p和-27b水平越高；可作為疾病嚴重程度與臨床預后的重要預測指標〔13〕。

許潑實等〔14〕研究指出，與PCa相關(guān)的癌基因有miR-184、210、370、503等，相關(guān)抑癌基因有miR-7b、23a、26a、125b、143、221等。韓澤平等〔15〕研究指出，運用生物信息學方法對PCa相關(guān)miRNAs分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行預測，不僅能揭示各miRNAs生物學功能，還能闡明其與PCa相關(guān)的發(fā)病機制。PCa發(fā)生是一個多因素、多基因、多個階段最終形成的極其復雜的生物學現(xiàn)象，目前研究集中證實了miR-21、-145、-221和-222基因表達異常與PCa的關(guān)系〔16〕。miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA的3′非編碼區(qū)不完全互補配對，實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控。結(jié)合前列腺基因數(shù)據(jù)庫中PCa相關(guān)基因，得到細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKN)1A、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)、表皮生長因子受體(ErbB)2、MYC、腫瘤蛋白(TP)53、雌激素受體(ESR)1和B淋巴細胞瘤基因(BCL)2共7個共同靶基因與PCa密切相關(guān)〔17〕。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，既可激活基因的表達，也可抑制基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)〔18〕，CDX2可能為多個靶基因的共同轉(zhuǎn)錄因子，在PCa中陽性表達率較高。