多巴胺轉運體基因多態性與帕金森病的易感性及PET/CT顯像

常培葉 趙 平 王雪梅 王春梅 包寶亮

(內蒙古醫科大學附屬醫院核醫學科，內蒙古 呼和浩特 010050)

帕金森病(PD)是中老年人常見的神經退行性疾病，主要病理特征是黑質多巴胺能神經元的變性，導致腦內多巴胺含量減少，臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩、自主運動減少等。PD發病率隨著年齡增加而逐漸升高，在我國北京、西安和上海的PD流行病學調查發現，PD在65歲以上人群中的發病率為1.7%，已經接近發達國家〔1〕。研究認為PD是一種復雜的多因素疾病，它的發病受到環境〔2〕和遺傳因素的共同影響，其中遺傳因素起主要作用〔3〕。多巴胺轉運體(DAT，基因名：SLC6A3)是調節突觸間隙多巴胺濃度的關鍵蛋白質，DAT的主要功能是對釋放到突觸間隙的多巴胺進行再攝取，從而終止神經細胞間的信息傳遞〔4〕。研究〔5，6〕表明，DAT基因變異與PD的易患性有關。本研究DAT基因3′非翻譯區可變串聯重復序列(VNTR)多態性與內蒙古地區PD的相關性，分析VNTR多態性與紋狀體DAT11C-甲基-N-2β-甲基酯-3β-(4-F-苯基)托烷(11C-β-CFT)腦顯像攝取之間的關聯性，探討DAT基因VNTR變異在內蒙古地區PD發病中的作用。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2015年就診于內蒙古醫科大學附屬醫院門診及住院的PD患者52例為PD組，其中男23例，女29例；年齡40～70歲，平均(62±3.24)歲；霍思亞布爾(Hoehn-Yahr)評分1.0～2.0，平均1.5。納入標準：①符合英國PD協會腦庫標準制定的PD診斷標準，以及中華醫學會神經病學會制定的PD診斷標準。②患者口服美多巴制劑后療效明顯，且均未接受過PD顱內手術治療。③排除帕金森綜合征、腦血管疾病、中毒、顱內感染、顱腦外傷等器質性病變，以及血管性癡呆、路易體癡呆、阿爾茨海默病等神經系統變性疾病。④排除陽性家族史，即該PD患者的一級或二級親屬，既往均無PD、阿爾茨海默病、路易體癡呆等神經系統變性疾病。內蒙古醫科大學附屬醫院健康體檢人員60例為對照組，男29例，女31例，年齡40～70歲，平均(54±2.58)歲。入選者為與PD組患者年齡、性別匹配的健康志愿者，且滿足以下條件：①對照組與PD組及對照組個體之間均無血緣關系。②排除PD、阿爾茨海默病、路易體癡呆等神經系統變性疾病病史，且無服用精神病藥物史。兩組均知情同意且性別、年齡一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2DAN提取方法 采用試劑盒法進行DNA的提取并進行DNA濃度、純度檢測。

1.3VNTR多態位點基因分型方法 采用高溫連接酶檢測反應(LDR)進行VNTR多態位點的基因分型。①PCR擴增。PCR反應體系如下：1×緩沖液2 μl，20 ng 模板1 μl，3 mmol/L鎂離子(Mg2+)0.6 μl，2 mmol/L/脫氧核苷三磷酸(dNTP)2 μl，1 U DNA聚合酶(Taq)0.2 μl，1×溶液4 μl，0.5p引物混合物2 μl，水8.2 μl，總體積20 μl。PCR 反應條件：起始95℃變性15 min，然后94℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，反應35個循環，最后72℃延伸10 min。反應結束后用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。②LDR進行基因分型。LDR反應體系如下：1×緩沖液1 μl，12.5 pmol/μl/探針混合物1 μl，2 U連接酶0.05 μl，100 ng/μl PCR產物1 μl，水6.95 μl，總體積10 μl。反應條件：95℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 2 min，反應35個循環。反應結束后，用GeneMapper 3.0軟件進行數據分析和基因分型。

1.411C-β-CFT DAT正電子發射計算機斷層顯像(PET)/CT腦顯像 20例臨床確診PD患者和10例對照者使用GE Discovery 710 顯像設備進行DAT PET-CT顯像研究，受試者經肘靜脈注射11C-β-CFT 30 min后進行DAT腦顯像，采集模式為3D，發射采集計數為3×10計數，取CT圖像中紋狀體影像最清晰的3幀橫斷層圖像，在每一層面上分別勾畫出雙側尾狀核、雙側殼核及小腦(CB)感興趣區(ROI)，用計算機軟件自動得出各ROI的平均放射性計數，計算各區 DAT 結合量指數：(ROI-CB)/ CB，以三層的平均計數計算此比值，獲得這些區域的11C-β-CFT攝取指數，以此來反映這些區域DAT的數量。為保證 ROI 的大小與位置在每一位受試者間的一致性，ROI均由 1 名核醫學專業主治醫師獨立勾畫。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1VNTR多態性分析 VNTR的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。VNTR有9R和10R兩個等位基因，VNTR基因型頻率和等位基因頻率在對照組和PD組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2紋狀體11C-β-CFT放射性計數分析 對照組DAT顯像清晰放射性攝取均勻對稱。與對照組比較，PD組雙側尾狀核、前殼核和后殼核攝取11C-β-CFT放射性計數比值顯著減低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、圖2、表2。

表1 兩組VNTR基因多態性比較〔n(%)〕

圖1 對照組11C-β-CFT-PET-DAT腦顯像圖

圖2 PD組11C-β-CFT-PET-DAT腦顯像圖

表2 兩組紋狀體11C-β-CFT-PET-DAT顯像結果比較

與對照組比較：1)P<0.05

2.3相關性分析 紋狀體11C-β-CFT放射性計數與VNTR的10R-10R、10R-9R、9R-9R的基因型頻率無明顯相關性(P>0.05)。

3 討 論

人類DAT基因由SLC6A3基因編碼，位于染色體5pl5.3，包含15個外顯子，全長64 Kb。其編碼區表現出較強的保守性，因此SLC6A3基因表達的個體差異可能來自于調控序列，研究較多的是其3′非翻譯區(3′UTR)一個40 bp串聯重復序列VNTR的多態性，有研究表明，VNTR多態會影響DAT基因的表達，并與PD的易患性有關〔7〕。在高加索人群和中國廣州人群的兩項研究中均發現11次拷貝重復等位基因導致基因表達的增強，使神經毒素進入多巴胺能神經元增多，最終導致多巴胺能神經元變性壞死〔8〕。但部分研究結果不支持DAT基因多態與PD的關聯〔9〕，其原因可能在于人種、種群和地域的差異。借助單光子發射計算機斷層顯像(SPECT)和PET技術，使人們能夠在活體內對與疾病發生、發展密切相關的生物學標志物進行檢測〔10〕，相比于SPECT顯像，PET顯像具有更高的空間分辨率和圖像質量，顯示出更明顯的應用優勢〔11〕。研究〔12〕表明，PD患者黑質紋狀體多巴胺神經元的變性脫失伴隨突觸前膜DAT數量及功能的明顯下降，兩者的變化相一致。DAT顯像可用于評價紋狀體突觸前的多巴胺能神經纖維末梢的功能狀態，是目前最敏感的PD標志物。本研究發現DAT基因的VNTR 3種基因型頻率分布在對照組和PD組并沒有統計學差異，且未發現紋狀體11C-β-CFT放射性計數與VNTR基因型之間的相關性。這可能是由于樣本量太小，在今后的研究中需增加樣本量，根據年齡、性別及發病特征等進行詳細分類統計。盡管本研究未能得出基因位點突變與PD遺傳易感性有關的結論，但這并不能排除其在PD發病中的作用， 有待進一步研究。