老年抑郁癥患者血漿腦源性神經營養因子水平與G196A基因多態性的相關性

王麗娜 馬金芳 王秀娟 張美霞 王 娟

(新鄉醫學院第二附屬醫院精神科，河南 新鄉 453002)

抑郁癥為精神障礙性疾病，以顯著而持久的心境低落、思維和行為異常為主要臨床特征〔1〕，近年來老年抑郁癥發病率逐年上升〔2，3〕。老年抑郁癥病因復雜，與大腦神經遞質減少、激素異常、內分泌系統變化及大腦神經纖維攝氧不足、下丘腦-垂體-腎上腺-軸功能障礙等密切相關〔4,5〕。腦源性神經營養因子(BDNF)對神經元的生長、發育、存活及突觸可塑性具有重要作用，其與抑郁的發病機制可能有重要關聯〔6〕。隨著人類基因組計劃的完成，研究發現BDNF水平、G196A基因多態性與抑郁相關〔6，7〕。但目前國內外尚缺乏關于老年抑郁癥血漿BDNF水平與G196A基因多態性的相關性研究。因此，本研究探討老年抑郁癥患者血漿BDNF水平與G196A基因多態性的相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2016年1月至2017年4月新鄉醫學院第二附屬醫院確診的90例老年抑郁癥患者為研究組，入選標準：符合中國精神疾病分類方案與診斷標準修訂版(CCMD-2-R)抑郁癥及美國精神障礙診斷手冊第4版(DSM-W)抑郁障礙的診斷標準〔8〕、17 項漢密爾頓抑郁量表評分>17分〔9〕、年齡>60歲、無神經障礙及癡呆。選取同期17 項漢密爾頓抑郁量表評分<7分的60例健康體檢者作為對照組，排除標準：嚴重軀體疾病及精神障礙、意識障礙、運動視覺或聽覺異常、嚴重癡呆。研究組男38例、女52例，年齡61～80歲，平均(67.35±6.57)歲；對照組男23名，女37名，年齡61～77歲，平均(67.32±7.12)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象知情同意。

1.2BDNF水平的檢測 分別抽取研究對象早晨空腹靜脈血3 ml，放入采血管中(不加抗凝劑)，于25℃、轉速3 000 r/min離心10 min，分離血漿；采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿中BDNF水平，操作步驟按照BDNF試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)說明書進行。

1.3G196A基因多態性的檢測 分別抽取研究對象早晨空腹靜脈血3 ml，放入采血管中(不加抗凝劑)，于25℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80℃凍存備用。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法檢測血清中G196A基因：用Trizol試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取血清中總RNA，計算提取的RNA的純度后，按照mRNA逆轉錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說明書進行逆轉錄全成cDNA；采用Primer5.0軟件設計引物，上游引物為5′ACTCTGGAGAGCGTGAAT3′，下游引物為5′ ATACTGTCACACACGCTC3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成，并經NCBI數據庫同源性比對；以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：95℃，(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s)共40個循環；72℃延伸5 min，96孔板，并設3個復孔，以重水為陰性對照。取PCR擴增產物(308 bp)，加入5 U Nia限制性內切酶(新英格蘭生物實驗)，置37℃水浴消化6 h后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離(100 V電壓電泳2 h，硝酸銀染色分型)。擴增片段長度243、59、6 bp的為G/G 型，168、75、59、6 bp的為A/A 型，43、168、75、59、6 bp的為G/A 型。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2和t檢驗、Pearson相關性分析及多元逐步回歸分析。

2 結 果

2.1兩組血漿BDNF水平比較 研究組血漿BDNF水平〔(10.47±3.15)μmol/L〕顯著低于對照組〔(16.13±2.54)μmol/L〕(P<0.05)。

2.2兩組G196A基因多態性比較 G196A基因PCR特異性擴增產物約為500 bp(圖1)。當等位基因為A型時，PCR擴增產物片段長度為500 bp的1條電泳帶；等位基因為G型時，PCR擴增產物片段長度為131 和369 bp的2條電泳帶；等位基因為AG型時，PCR擴增產物片段長度為131、369和500 bp的3條電泳帶(圖2)。研究組G196A基因型分布頻率、等位基因分布頻率和等位基因攜帶分布頻率與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3Pearson相關性分析及多元逐步回歸分析結果 Pearson相關性分析結果顯示，老年抑郁患者血漿中BDNF水平與G196A等位基因分布頻率呈負相關(r=-0.674，P<0.05)。多元逐步回歸分析結果顯示，血漿BDNF水平與G196A等位基因多態性密切相關(P<0.01)。見表2。

表1 兩組G196A基因型分布及等位基因攜帶的比較〔n(%)〕

A+表示AA+GA；A-表示GG；G+表示GG+GA；G-表示AA

表2 血漿BDNF水平與G196A等位基因分布頻率的相關性

圖1 G196A基因PCR擴增產物的電泳圖

圖2 G196A酶切電泳

3 討 論

老年抑郁癥發病機制復雜，可伴隨有軀體生理的變化、神經細胞因缺少營養發生皺縮、腦發生萎縮，引起神經系統功能的衰退，去甲腎上腺素、多巴胺、乙酰膽堿等的分泌水平和下丘腦-垂體-腎上腺軸及下丘腦-垂體-甲狀腺軸等的損傷均與老年抑郁密切相關〔10,11〕。BDNF可通過降低神經細胞對缺血狀態的反應，延緩缺血后神經細胞的死亡時間，恢復缺血后神經細胞的功能，對缺血后腦神經細胞具有保護作用〔12,13〕。BDNF可穿過血腦屏障，血漿中BDNF水平可反映腦組織中BDNF含量。G196A基因是由第196位堿基鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)而形成，其影響成熟BDNF的生成，參與多種精神疾病，是學習記憶、神經元突觸可塑性形成過程中的重要蛋白分子。G196A基因多態性可影響細胞內的蛋白轉運和分泌，G196A等位基因頻率可反映蛋白細胞的內轉運和活性〔14〕。老年抑郁癥患者機體功能發生了退行性改變，使體內環境中細胞因子出現了相應改變、神經細胞發生了分化凋亡，喪失了對神經細胞的再生修復及保護的作用〔15〕；G196A基因多態性的改變，改變了患者細胞內pro-BDNF的蛋白轉運和分泌水平，影響成熟BDNF的生成和活性，進而影響患者神經細胞的可塑性和再生能力。BDNF通過與高親和力的酪氨酸激酶受體結合，刺激和促進神經細胞生長分化、維持神經細胞存活和正常功能、防止神經元受損死亡，BDNF基因調控BDNF的表達水平〔16〕。BDNF分泌減少可影響患者的記憶功能及海馬體積，增加抑郁癥、精神分裂癥等的易感性，使患者認知功能下降〔17〕。因此，血漿BDNF水平的降低、G196A基因多態性的改變、血漿中BDNF水平與G196A基因多態性密切相關，可作為老年抑郁癥的生物學指標。