Rho相關信號通路對類風濕關節炎患者FLS活性的影響

鄒晉梅

(綿陽市中心醫院，四川 綿陽 621000)

類風濕關節炎患者關節成纖維樣滑膜細胞(FLS)不僅參與滑膜炎癥，還具有腫瘤細胞樣特征，較正常滑膜細胞更具遷移和侵襲力，在類風濕關節炎關節滑膜增生和組織破壞中發揮關鍵作用〔1〕。Rho激酶(ROCK)是RhoA下游的重要信號蛋白，RhoA/ROCK信號通路具有多種生物學功能，其中包括多腫瘤細胞活性的調控〔2〕。動物實驗發現，RhoA、ROCK在類風濕關節炎模型大鼠的滑膜中表達水平均明顯提升，并參與滑膜炎癥反應〔3〕，但未闡明該信號通路是否調控FLS的遷移、侵襲、增殖。本研究旨在探討RhoA/ROCK信號通路對類風濕關節炎FLS活性的調控作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2017年1～6月綿陽市中心醫院收治的類風濕關節炎患者10例為類風濕關節炎組；另取同期行骨關節炎患者為骨關節炎組和4例無關節炎病史外傷者為對照組。入選患者均行關節鏡或關節置換手術，本實驗經醫院倫理委員會審批，簽署知情同意書。

1.2滑膜細胞分離與培養 術中取患者滑膜組織，無菌條件下移至培養皿中，剪碎后與Ⅰ型膠原酶混合，放入細胞培養箱中常規條件下孵育5～8 h。過10 μm孔徑篩網，濾液轉至10 ml離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中培養24 h，取培養瓶壁上黏附的FLS。形態學和免疫組化檢測FLS標志物(CD55、CD106)，鑒定出FLS，繼續培養3～5代用于實驗。根據實驗需要，分別用RhoA抑制劑(C3轉化酶)和ROCK抑制劑(Y-27632)處理類風濕關節炎患者FLS。

1.3FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物表達檢測 蛋白質提取試劑盒提取FLS總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定濃度。Western印跡檢測RhoA活性標志物(GTP-RhoA)和ROCK活性標志物(磷酸化MYPT1)表達水平。取100 μg總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，滴加兔抗人RhoA多克隆抗體(1∶300)、兔抗人MYPT1多克隆抗體(1∶500)、兔抗人磷酸化MYPT1多克隆抗體(1∶1 000)，選用兔源性β-actin多克隆抗體(1∶2 000)為內參，4℃孵育過夜；洗膜后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下反應1 h。電化學發光法(ECL)顯色，讀取目標條帶灰度值。

1.4FLS遷移、侵襲、增殖能力檢測 采用趨化性遷移實驗測定FLS遷移能力，密度為6×105的FLS接種到200 μl無血清DEME培養基中，種植到Transwell小室濾網，37℃培養1 h；將含10%FBS DEME培養基加入下室，相同條件培養12 h。按實驗需求，分別用終濃度為10 mg/L的C3轉化酶、10 μmol/L的Y-27632預處理2 h；計數遷移到下室的細胞數量。侵襲能力檢測：先用MATRIGEL基質包被Transwell小室，之后實驗操作同上。增殖能力檢測：分別用不同濃度的C3轉化酶、Y-27632預處理2 h，之后用10 μg/L的白細胞介素(IL)-1α刺激48 h，MTT法測定FLS增殖能力。

1.5FLS骨架蛋白F-actin表達檢測 用10 mg/L的C3轉化酶、10 μmol/L的Y-27632預處理類風濕關節炎患者FLS 2 h，之后用IL-1α刺激12 h。行細胞免疫熒光檢測，將FLS種植于細胞爬片，培養至細胞密度為75%～80%時棄去培養液，甲醛固定細胞，-20℃靜置5 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，分為3組，均滴加IL-1α一抗(1∶50)，另外兩組分別滴加C3轉化酶一抗(1∶100)、Y-27632一抗(1∶100)，4℃過夜，滴加熒光Ⅱ抗，室溫下避光靜置1 h，細胞核DAPI染色5 min，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6統計學分析 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物表達情況 類風濕關節炎組FLS中GTP-RhoA、總RhoA蛋白相對表達量〔(7.61±1.38)、(5.08±0.75)〕明顯高于骨關節炎組〔(3.17±0.52)、(2.38±0.23)〕和對照組〔(3.03±0.39)、(2.15±0.17)〕，差異有統計學意義(P<0.05)。類風濕關節炎組磷酸化MYPT1、MYPT1蛋白相對表達量〔(12.95±3.58)、(8.13±1.06)〕明顯高于骨關節炎組〔(6.37±0.82)、(5.08±0.47)〕和對照組〔(4.51±0.67)、(5.39±0.53)〕，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

1 類風濕關節炎組；2 骨關節炎組；3 對照組圖1 3組FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物檢測

2.2RhoA、ROCK抑制劑對類風濕關節炎FLS遷移、侵襲能力的影響 單純FBS組、FBS+C3轉化酶組、FBS+Y-27632組遷移細胞數分別為(81.00±12.00)個、(49.00±14.00)個、(36.00±8.00)個；侵襲實驗顯示，MATRIGEL基質細胞數分別為(58.00±9.00)個、(40.00±9.00)個、(24.00±7.00)個。FBS+C3轉化酶組、FBS+Y-27632組遷移細胞數及MATRIGEL基質細胞數均明顯少于單純FBS組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3RhoA、ROCK抑制劑對類風濕關節炎FLS增殖的影響 單純IL-1α組吸光度為(1.36±0.28)；不同濃度的C3轉化酶(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分別為(1.15±0.31)、(0.76±0.42)、(0.65±0.38)、(0.51±0.31)、(0.47±0.15)；不同濃度Y-27632(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分別為(1.20±0.28)、(1.03±0.20)、(0.82±0.25)、(0.57±0.16)、(0.49±0.11)。與單純IL-1α組相比，當C3轉化酶濃度20 mg/L、Y-27632濃度40 mg/L以上時，對類風濕關節炎FLS的增殖抑制作用差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4類風濕關節炎FLS骨架蛋白F-actin表達情況檢測 紅色為骨架蛋白F-actin，藍色為細胞核(DAPI)，C3轉化酶和Y-27632可顯著抑制類風濕關節炎FLS的F-actin聚合。見圖2。

圖2 RhoA、ROCK抑制劑對FLS骨架蛋白F-actin表達的影響(免疫熒光，×100)

3 討 論

類風濕關節炎的病理特征包括炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、骨質破壞等；滑膜細胞異常增殖、活化，表現出侵襲性是類風濕關節炎進展的關鍵環節〔4〕。活化的滑膜細胞在無炎性因子等外來刺激時仍能夠保證增殖和侵襲性〔5〕。滑膜細胞持續增殖可導致類風濕關節炎滑膜組織增生變厚，并向關節腔轉移、侵襲，破壞關節軟骨及周圍組織〔6〕。本研究表明，類風濕關節炎滑膜細胞的生物行為已出現異常改變，與正常滑膜細胞存在差異。臨床研究顯示，部分患者即使炎癥得到控制，但關節軟骨及周圍組織的破壞仍在繼續〔7〕，該作用機制目前尚未明確。動物實驗顯示，通過抑制小鼠FLS的遷移、侵襲，可有效控制類風濕關節炎病情發展〔8〕，但調控機制仍未明確。

細胞的遷移、侵襲是一個復雜的生理過程，受多種因素調控。RhoA蛋白為具有多種生物學活性的GTP酶，ROCK是其下游一個關鍵的信號調控蛋白，在RhoA活化信息傳導方面具有重要作用。ROCK被RhoA激活后，將MLC酶磷酸化，引發細胞骨架聚合，增強細胞收縮，促進細胞前移。RhoA、ROCK信號通路在腫瘤細胞轉移、侵襲方面具有明顯調控作用，Rho蛋白也可能參與類風濕關節炎的發病機制〔9〕。本研究提示RhoA/ROCK信號通路可能參與調控類風濕關節炎FLS的遷移、侵襲。FLS異常增殖也是類風濕關節炎關節破壞的因素之一，本研究中RhoA、ROCK特異性抑制劑呈劑量依賴性低抑制FLS增殖。細胞骨架聚合是細胞遷移、侵襲、增殖的關鍵因素，本研究提示RhoA/ROCK信號通路通過影響細胞骨架聚合來調控FLS的遷移、侵襲、增殖。