解毒通絡調肝方對2型糖尿病大鼠肝組織中肌醇依賴酶1/c-Jun氨基末端激酶通路相關蛋白表達的影響

樸春麗 劉向榮 金美英 唐 程 王 麗

(廣州中醫藥大學深圳醫院(福田)，廣東 深圳 518034)

內質網應激(ERS)是2型糖尿病(T2DM)發病的重要環節，對于ERS的研究開始于2002年，Harding等〔1〕提出了T2DM通過ERS而發病。肌醇依賴酶(IRE)1/JNK信號通路是ERS參與胰島素抵抗(IR)和胰島β細胞凋亡的主要信號通路〔2〕。本課題組前期實驗證實解毒通絡調肝方具有多靶點、多通路改善IR和保護胰島β細胞功能的作用，本文對其相關機制進行進一步探討〔3,4〕。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與飼養 ZDF大鼠88只，ZL大鼠10只，均為雄性9周齡、SPF級(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，許可證編號：(SCXK京 2012-0001)。實驗大鼠飼養于潔凈動物房，置于潔凈動物櫥中(北京文慧凈化設備廠制造，專利號：EJ932041477)，環境溫度控制在23～25℃，相對濕度50%～60%，當天禁食不禁水，所有大鼠自由飲水。

1.1.2藥物 解毒通絡調肝方(榛花15 g、大黃30 g、黃連15 g、雙花15 g、黃芪30 g、丹參15 g、柴胡10 g，長春中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，4℃保存)；對照藥物為鹽酸二甲雙胍片(天津太平洋制藥有限公司，國藥準字：批號 080313)。

1.1.3試劑 一抗：IRE1-抗-IRE1抗體，批號：ab37073/GR82255-15；p-IRE1-抗-IRE1(phospho S724)抗體，批號：ab48187/GR229154-2；JNK-抗- JNK1+JNK2+JNK3抗體，批號：ab179461/GR209447-4；P-JNK-抗-JNK1+JNK2 (phospho T183+Y185)抗體，批號：ab4821/GR87526-29；廠家：Abcam。二抗：山羊抗兔IgG(HRP)，批號：ab6721/GR231489-7。廠家：Abcam。磷酸二氫鈉，西隴化工廠，批號：0908011；磷酸氫二鈉，批號00100708；檸檬酸，批號：20130109；甲醇，批號：20140706；30%過氧化氫，批號：20140416；廠家：北京儀工廠。山羊血清，中杉金橋，批號：WK153325；Triton，批號：95500140，廠家：Sigma。

1.1.4實驗儀器 電熱恒溫培養箱，華連理化器材廠；羅氏血糖儀及配套血糖試紙；普通光學顯微鏡，Olympus L340099；低溫高速離心機，GermanyMlKR002R；輪轉式組織切片機；桌式振蕩器；日本日立7160全自動生化儀；精密電子天平(MettleAE160)；TOAHM-20E pHMrter，日本。

1.2實驗方法

1.2．1動物模型的建立 88只9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養,10只9周齡雄性ZL鼠以#1022普通飼料維持飼養。飼養過程中動態觀察大鼠隨機血糖的變化，隨機血糖≥11.1 mmol/L視為T2DM成模。第10周對ZDF大鼠隨機血糖監測結果：<11.1 mmol/L 34只；11.1～16.9 mmol/L 18只；>16.9 mmol/L 36只。根據上述3種血糖梯度，大鼠重新分籠，>16.9 mmol/L的大鼠移至通風較好的環境喂養，排除環境因素對血糖的影響。將未符合成模標準的大鼠重新隨機分組飼養，并隨機測量血糖，已成模的大鼠測血糖，判斷其模型的穩定性及持續性。按照上述方法至第13周成功制備T2DM大鼠模型59只，將已成模的ZDF大鼠隨機分組。

1.2．2實驗分組 10只ZL大鼠作為空白對照組；成模ZDF大鼠隨機分為模型組(15只)，西藥組(11只)，解毒通絡調肝方大劑量組(11只)、中劑量組(11只)、小劑量組(11只)。

1.2．3給藥 第17周開始給藥，西藥組：臨用前將二甲雙胍攪拌至完全溶解，用蒸餾水稀釋，給藥劑量為0.75 g/60 000×7倍。解毒通絡調肝方大、中、小劑量組：蒸餾水稀釋，灌胃劑量為5、3、1 g·kg-1·d-1(按所含原藥材量計算)。模型組與空白對照組以等體積蒸餾水灌胃，1次/d，灌胃時間均為每日上午9∶00，持續4 w。

1.2．4觀察指標及檢測方法

1.2.4.1觀察指標 IRE1、P-IRE1、JNK，P-JNK表達水平。

1.2.4.2檢測方法 一抗稀釋濃度：IRE1 1∶325，P-IRE1 1∶90，JNK 1∶75，P-JNK 1∶1 000；二抗稀釋濃度：1∶1 000。實驗步驟：肝組織從-4℃復溫 30 min；常規脫蠟;Triton 37℃ 10 min,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)3 min×3；H2O2-CH3OH，10 min避光,0.01 mol/L PBS 3 min×3；微波修復，自然冷卻1 h，0.01 mol/L PBS 3 min×3；加蛋清20 min 0.01 mol/L PBS 3 min×3；加山羊血清30 min 37℃，甩去；滴加一抗4℃過夜；從4℃復溫1 h，0.01 mol/L PBS 3 min×3；滴加二抗37℃ 30 min。0.01 mol/L PBS 3 min×3；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察；自來水洗，ddH2O水洗；蘇木素復染、自來水沖洗；常規脫水；中性樹膠封片，鏡下觀察結果。

2 結 果

2.1各組大鼠肝臟IRE1、P-IREI蛋白表達水平 空白對照組肝細胞胞質中無棕黃色顆粒狀反應物。模型組肝細胞質中有棕黃色顆粒狀反應物，說明有IRE1、P-IREI蛋白表達。與空白對照組比較，模型組、西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組肝細胞質中IRE1、P-IREI蛋白表達均增多(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組肝細胞質中IRE1、P-IREI蛋白表達明顯減少(P<0.01)；給藥后，與解毒通絡調肝方中劑量組比較，解毒通絡調肝方大、小劑量組肝細胞質中IRE1、P-IREI蛋白表達增加(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2各組肝臟JNK、P-JNK蛋白表達的比較 空白對照組肝細胞質無棕黃色顆粒狀反應物。模型組肝細胞質有棕黃色顆粒狀反應物，JNK、P-JNK蛋白強陽性表達。與正常對照組比較，模型組、西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組肝細胞質中JNK、P-JNK蛋白表達增多(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡調肝方大、中、小劑量組肝細胞質中JNK、P-JNK蛋白表達減少(P<0.05，P<0.01)；與解毒通絡調肝方中劑量組比較，大、小劑量組肝細胞質中JNK、P-JNK蛋白表達增加(P<0.05)。見表1，圖2，圖3。

表1 各組大鼠肝組織IRE1、P-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；與中藥復方中劑量組比較：5)P<0.05

圖1 免疫組化方法檢測肝組織p-IRE1蛋白表達(×400)

圖2 免疫組化檢測肝組織JNK蛋白表達(×400)

圖3 免疫組化檢測肝組織p-JNK蛋白表達(×400)

3 討 論

T2DM歸屬于中醫消渴病的范疇，因嗜食肥甘、厚味，勞逸失常等導致脾胃的功能受損，脾氣虛弱水谷精微化生不足，清氣不升，濁氣不降，氣機壅滯而化生為瘀血痰濁，日久淤而化熱，痰、濕、濁、瘀、熱邪相互膠著致病，是 T2DM、IR 毒邪形成的物質基礎。本研究導師從“毒損肝絡”論治T2DM、IR，根據“毒邪”理論與“絡病”理論的基本病機，創立解毒通絡調肝法為治療 T2DM、IR 的大法〔5〕。基于此創立解毒通絡調肝方，以榛花、大黃解毒，排毒為君藥；黃連、雙花清熱解毒，燥濕祛濁；黃芪、丹參益氣通絡，扶正祛邪，共同增強君藥的作用，為臣藥；柴胡引諸藥入肝經，調暢氣機，為佐使藥。全方攻補兼施、扶正祛邪。對于 T2DM患者臨床治療效果顯著，大量實驗也證明解毒通絡調肝方可通過抗炎癥因子的作用對T2DM發揮治療作用〔6〕。

IR是T2DM主要危險因素。疾病的前期，機體通過提高β細胞的數量和胰島素的分泌量改善IR，當β細胞的數量和胰島素的分泌量不能滿足機體需要時，這種穩態被打破，胰島素的相對不足就會隨之出現，T2DM隨之發生〔7〕。文獻報道，IR發生的依賴機體內質網應激的啟動，IRE1、RNA依賴的蛋白激酶樣激酶(PERK)、活化轉錄因子(ATF)6是內質網上3種跨膜蛋白感受器，用于感受未折疊或錯誤折疊蛋白質信號，并將此信號傳遞到細胞基質〔8〕。ERS激活的 IRE1α/JNK 信號通路可以導致胰島素受體及其底物功能障礙，是發生IR和β細胞凋亡的重要原因〔9，10〕。JNK信號通路是當未折疊或者是錯誤折疊蛋白過度累積時，IR發生，IRE-1α與Bip/Grp78分離，在Ser724點位上發生磷酸化及寡聚化反應，形成P-IRE1α，Yamaguchi〔11〕證明凋亡信號調節激酶ASK1自身可以通過ASK-p38路徑誘導細胞凋亡，形成IRE-TRAF2-ASK1復合體，激活JNK，激活線粒體依賴的細胞凋亡 。JNK被激活后可促進胰島素受體底物絲氨酸的磷酸化，阻礙胰島素的信號轉導，最終促使炎癥細胞表達，引起ERS，導致IR〔12〕。

本實驗中ZDF鼠存在高糖、高脂、肥胖應激狀態，并且給藥前肝細胞質中均有IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK 蛋白表達，證實了通過給予Purina #5008高脂飼料，ZDF鼠可誘導形成糖尿病模型；同時，解毒調肝通絡方及二甲雙胍均能通過減少IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK 蛋白的表達，抑制IREl-JNK信號通路，起到改善IR、減少細胞凋亡的作用；而且解毒通絡調肝方中劑量組有較好的改善IR、減少凋亡的作用，但是鑒于本實驗局限于免疫組化定性研究，需進一步定量研究以證實。