祁州漏蘆水提物對二乙基亞硝胺/乙酰氨基芴誘發大鼠肝臟癌前病變的抑制作用

金梅花 崔香丹 尹學哲 全吉淑

(延邊大學醫學院，吉林 延吉 133000)

祁州漏蘆是菊科植物Rhaponticum uniflorum(L.) DC.的干燥根〔1〕，具有增強免疫、抗氧化、抗衰老、抗炎等藥理作用〔2～5〕。本課題組研究發現，祁州漏蘆能預防多種因素引起的肝損傷，并抑制小鼠H22移植瘤生長〔6～8〕。本文主要探討祁州漏蘆水提物(RUWE)對癌前病變初期大鼠肝臟標志酶及肝臟抗氧化酶的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 乙酰氨基芴(AAF)和二乙基亞硝胺(DEN，Sigma公司)；γ-谷氨酰胺轉肽酶(GGT)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)P、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及過氧化氫酶(CAT)測試盒(南京建成生物工程研究所)；兔GGT多克隆抗體及小鼠GSTP單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2藥物 將祁州漏蘆切碎，加水煎煮，減壓蒸餾即得RUWE，主要成分為多糖(81%)和甾酮(13%)〔5〕。

1.3動物分組與處理 將Wistar大鼠(雄性，體重150～180 g)隨機分為對照組(假手術組)、模型組和RUWE組。改良Solt-Farber法復制大鼠肝癌前病變模型〔4～6〕，即第1周一次性腹腔注射200 mg/kg DEN啟動化學誘癌過程；第3周末施行2/3肝切除術，并從第3周開始飼喂0.008% AAF，持續到第8周末實驗結束為止，以完成促癌過程。RUWE組第3周開始飼喂0.008% AAF和100 mg/kg RUWE，持續至第8周末實驗結束；對照組腹腔注射生理鹽水，第3周末施行肝切除術。

1.4取材及血清指標測定 第8周末實驗結束時，將各組大鼠麻醉后心臟采血并分離血清，按測試盒操作方法測定血清GGT、ALT、AST活性。

1.5肝組織病理及生化指標測定 將肝組織塊固定，石蠟包埋、切片、HE染色后，在光鏡下觀察肝組織病理學變化，蛋白印跡法檢測細胞GSTP和GGT蛋白的表達。制備肝勻漿，按照測試盒操作方法測定SOD、GPX、CAT、GST、MDA水平。

1.6統計學方法 數據用Prism5.0統計軟件處理，以單因素方差分析進行統計。

2 結 果

2.1RUWE對各組血清GGT、AST和ALT活性的影響 模型組血清GGT、AST和ALT活性顯著高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，RUWE組血清GGT、AST和ALT活性顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2RUWE對各組肝臟抗氧化酶活性的影響 與對照組比較，模型組肝組織勻漿SOD、GPX、CAT活性均顯著降低(P<0.05)，GSTP活性和MDA含量顯著增高(P<0.05)。而RUWE顯著降低MDA水平(P<0.05)，提高SOD活性(P<0.05)。與模型組比較，RUWE組肝組織CAT和GPX活性有上升趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清GGT 、ALT和AST活性及肝勻漿SOD、GPX、CAT、GSTP及MDA檢測結果比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下圖同

2.3蛋白印跡法檢測RUWE對各組肝組織GGT和GSTP表達的影響 與對照組比較，模型組肝組織GSTP和GGT蛋白表達增高(P<0.05)；與模型組比較，RUWE組肝組織GGT和GSTP蛋白表達降低(P<0.05)，提示RUWE對肝臟癌前病變具有保護作用。見圖1。

圖1 蛋白印跡法檢測各組肝組織GGT和GSTP表達

2.4RUWE對大鼠癌前病變初期肝組織病理學的影響 對照組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞結構完好。模型組大鼠肝細胞失去正常排列，肝小葉結構消失，匯管區有以卵圓細胞為主的小細胞增生，肝細胞水腫明顯，脂肪變性廣泛，形成脂肪空泡。RUWE組大鼠肝小葉結構基本存在，但肝細胞索排列紊亂，肝細胞炎性病變減輕，可見較多點狀壞死或灶狀壞死，核異型性大。見圖2。

圖2 肝組織病理學改變(HE，×200)

3 討 論

肝癌前病變是指病理上易發生癌變的肝組織異常，是指從肝臟出現炎癥、肝細胞水腫、細胞結節到肝細胞纖維化的演進過程，主要表現為肝組織非典型增生〔9，10〕。因此，本研究以肝癌前病變初期為切入點，以尋求延緩或阻滯肝細胞癌變進程的可能途徑。本研究通過改良Solt-Farber法復制大鼠肝癌前病變模型，其誘發的肝癌前病變與人體肝癌發生過程較為相似〔9，10〕。GGT和GSTP是肝癌前病變的重要標志之一〔9〕，RUWE可降低癌前病變大鼠肝組織GSTP和GGT蛋白的表達，降低血清GGT、ALT和AST活性，減輕肝細胞病變，提示RUWE對大鼠肝癌前病變具有抑制作用。腫瘤的發生和發展與自由基代謝有關。正常情況下，體內自由基的產生和清除處于動態平衡，抗氧化酶類與非酶抗氧化劑可組成一個防御系統，以清除體內過多的自由基，不至于引起細胞內過量脂質過氧化而出現細胞損傷〔9，10〕。肝細胞發生病變時體內自由基代謝失衡，自由基產生增多，對蛋白質、核酸和脂質等造成損傷〔9，10〕。本實驗結果也說明肝臟發生癌前病變后大鼠肝臟脂質過氧化水平升高，抗氧化能力下降，解毒酶活性增高，說明大鼠肝細胞存在一定氧化應激和細胞損傷。這一結果與文獻報道基本相符〔10〕。而RUWE可降低大鼠肝臟氧化應激水平，這有助于延緩肝細胞癌變進程。