褪黑素對大鼠乳腺癌腫瘤生長的影響

黃玉鈿 陳義忠 鄭 曦 薛玉欽 吳 進

(福建醫科大學附屬福州市第一醫院病理科，福建 福州 350009)

乳腺癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發病率在我國許多地區呈上升趨勢，嚴重威脅女性健康，乳腺癌發生發展的因素機制尚未完全明確，有研究表明機體內的神經內分泌器官松果體分泌的褪黑素(MLT)不僅具有抗氧化、調節內分泌、調控機體免疫等生理功能，其異常分泌與惡性腫瘤的發生發展也有密切關系〔1，2〕。有關調節MLT分泌能否影響乳腺癌進展過程的研究，有利于加深乳腺癌與內分泌關系的認識。本研究通過建立大鼠乳腺癌荷瘤模型，分析MLT與乳腺癌腫瘤體積、癌細胞核分裂指數、Ki67增殖指數等腫瘤生長指標的關系，探討MLT對乳腺癌細胞增殖水平、腫瘤生長程度的影響。

1 材料與方法

1.1動物選用和分組 選用清潔級SD雌性大鼠120只，2月齡，體重(200±10)g，標準顆粒飼料喂養，自由攝食飲水，于光照環境與黑暗環境下各12 h/d。隨機平均分成荷瘤對照組(G組)、荷瘤+生理鹽水組(M0組)、荷瘤+7.5 mg·kg-1·d-1MLT組(M1組)、荷瘤+15 mg·kg-1·d-1MLT組(M2組)。

1.2建立大鼠乳腺癌荷瘤模型 大鼠乳腺癌SHZ-88細胞株(購自中科院上海生命科學院)傳代培養，SHZ-88乳腺癌細胞株于25 cm3的培養瓶中貼壁生長，培養基為RPMI1640，含10%胎牛血清，每3天細胞密集成片時傳代1次，吸去舊培養基，加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌貼壁細胞2次，用0.25%胰酶消化1 min，倒置顯微鏡下觀察胞質縮小、貼壁細胞分離時吸去胰酶消化液，加入新培養基并吹打細胞使其脫壁，混勻后形成細胞懸液，分裝轉移至新培養瓶中傳代，加5 ml新培養基至每個培養瓶中，混勻后置入37℃含5%CO2的培養箱，傳代細胞于2 h后開始貼壁生長。取對數生長期細胞，制作SHZ-88大鼠乳腺癌單細胞懸液，按5×105個細胞/只大鼠對所有實驗大鼠接種細胞懸液1次，接種部位為大鼠大腿內側近腹股溝處皮下；從接種當日起，每日18∶00按照M0、M1、M2各組補充方案，行腹腔注射生理鹽水或MLT(美國Sigma-Aldrich公司產品)1次，連續注射9 d；接種后第10天荷瘤模型建立成功，接種處可觸及皮下腫塊形成。

1.3測量乳腺癌腫瘤體積 大鼠乳腺癌細胞接種后第10天，處死所有荷瘤大鼠，緊貼瘤體完整剝除乳腺癌組織，離體后測量腫瘤(圖1)，得到腫瘤最長徑(length)及與最長徑垂直的最大短徑(width)數值，腫瘤體積(cm3)=length×width2/2。

圖1 大鼠乳腺癌腫瘤體積、細胞核分裂象、Ki67表達

1.4蘇木精-伊紅(HE)染色法 大鼠乳腺癌組織經4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，組織包埋塊以5 μm厚度連續切片，采用HE染色法處理組織切片。HE染色步驟：切片經二甲苯脫蠟，通過梯度乙醇至水化后，蘇木精液染色8 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸-乙醇分化1 s，稍水洗后返藍，再流水沖洗2 min，0.5%伊紅液染色1 min，稍水洗后梯度乙醇脫水干燥，中性樹脂封片。顯微鏡下尋找大鼠乳腺癌組織切片中癌細胞的核分裂象(圖1)，隨機計數30個高倍視野(HPF，×400倍)中乳腺癌細胞核分裂總數，換算成平均每10個HPF的核分裂數，作為大鼠乳腺癌細胞核分裂指數(個/10HPF)。

1.5免疫組織化學法 大鼠乳腺癌石蠟包埋組織切片采用免疫組織化學Elivision二步法檢測切片中Ki67表達，Ki67抗體為兔抗大鼠多克隆抗體(購自美國Bio-Techne公司，工作液濃度為1∶100)，免疫組織化學Elivision試劑盒購自福州邁新公司。檢測步驟：石蠟包埋組織切片(5 μm厚度)，切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，檸檬酸高壓抗原修復，待冷卻后加PBS漂洗3次，每次3 min，滴加3%過氧化氫室溫下反應10 min，消除內源性過氧化物酶，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加Ki67一抗，室溫下孵育60 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加新配置的二氨基聯苯胺(DAB)染色劑，置于顯微鏡下觀察控制顯色時間，著色后蒸餾水沖洗以結束DAB染色，蘇木精襯染，流水沖洗，梯度乙醇脫水干燥后中性樹脂封片。同時檢測已知陽性切片以設立陽性對照，并采用PBS代替一抗作為陰性對照。Ki67陽性表達于大鼠乳腺癌細胞核上(圖1)，呈棕黃色，顯微鏡下觀察每張檢測切片中熱點區內5個高倍視野，計算每個高倍視野中Ki67陽性乳腺癌細胞數量/乳腺癌細胞總數的比例(%)，取平均值代表大鼠乳腺癌細胞Ki67增殖指數(%)。

1.6統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1G組與M0組乳腺癌腫瘤生長指標比較 G組乳腺癌腫瘤體積與M0組差異無統計學意義(P>0.05)。G組乳腺癌細胞核分裂指數與M0組差異無統計學意義(P>0.05)。G組乳腺癌Ki67增殖指數及M0組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組乳腺癌腫瘤體積比較 M1組、M2組乳腺癌腫瘤體積與G組和M0組比較均顯著縮小(P<0.05)。M1組與M2組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3各組乳腺癌細胞核分裂指數比較 M1組、M2組乳腺癌細胞核分裂指數與G組和M0組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。M1組與M2組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4各組乳腺癌Ki67增殖指數比較 M1組、M2組乳腺癌Ki67增殖指數與G組和M0組比較均顯著減小(P<0.05)，M2組明顯低于M1組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組乳腺癌腫瘤體積、細胞核分裂指數、Ki67增殖指數比較

與G組比較：1)P<0.05；與M0組比較：2)P<0.05；與M1組比較：3)P<0.05

3 討 論

MLT化學名稱是N-乙酰-5-甲氧色胺，是一種吲哚類激素，最早于1959年在牛的松果體中被發現，由于青蛙攝食后會出現蛙皮褪色，故將此激素命名為MLT。機體內的MLT主要由松果體分泌，具有顯著的晝夜節律性，分泌量峰值出現在夜晚，但夜間的光線照射能使血清MLT的峰值下降甚至分泌完全受抑制〔3〕。流行病學研究發現，長期夜班工作的女性患乳腺癌的風險明顯高于盲人婦女，夜晚工作環境的光線照射使MLT分泌的晝夜生理節律破壞、夜間血MLT水平降低，與血中雌激素水平上升及患乳腺癌風險的增高關系密切，在前列腺癌、結直腸癌患者中也發現存在血清MLT水平的下降，這些研究提示MLT具有抗腫瘤作用〔4，5〕。MLT的抗癌作用涉及多種途徑且機制復雜，除了具有抗雌激素作用，目前研究認為還與MLT促進細胞凋亡、抗氧化、調控細胞周期及調節免疫等機制有關〔6～8〕。

Ki67是一種核蛋白，由MKI-67基因編碼，與核糖體RNA轉錄有關，其失活使核糖體RNA合成受限，Ki67在細胞周期的多個階段均有表達，包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細胞分裂期(M期)，僅在細胞靜止期(G0期)不表達，故可作為反映細胞增殖活躍程度的標志物，Ki67增殖指數的高低與多種惡性腫瘤分化、浸潤及預后等密切相關〔9，10〕。本研究結果提示，MLT能延遲或阻留乳腺癌細胞從G0期到G1期的進程，使更多細胞處于G0期，從而下調乳腺癌細胞增殖活性和Ki67增殖指數；另外，MLT對乳腺癌細胞增殖活性的抑制作用具有劑量依賴性。Liu等〔11〕研究認為MLT能調節絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，抑制細胞外調節蛋白激酶(ERK)、蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化，下調細胞周期素(cyclin)和周期素激酶(CDK)mRNA及蛋白的轉錄表達，引起細胞周期阻滯從而抑制細胞增殖。Del Río等〔12〕研究表明MLT還能與鈣調蛋白(CaM)相結合，是CaM的內源性拮抗劑，具有阻斷GaM-微管蛋白復合體生成的作用，影響細胞內微管形成，甚至改變微管蛋白的結構從而造成微管破裂，抑制腫瘤細胞的分裂增殖。此外，Moreira等〔13〕研究發現，MLT還能上調促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、凋亡相關因子配體(Fas-L)的表達，激發凋亡級聯反應，誘導腫瘤細胞啟動凋亡程序，進一步降低增殖活性。

細胞周期中的M期即細胞核分裂期，通過計數腫瘤細胞核分裂象得出核分裂指數，可以反映腫瘤細胞分裂增殖的活性。本研究結果提示，補充MLT對乳腺癌細胞核分裂水平無顯著影響，不同于MLT對Ki67增殖指數的顯著影響。由于顯微鏡下計數的乳腺癌細胞核分裂象處于細胞周期的M期，而Ki67陽性表達的癌細胞不僅包括M期，也包括G1、S、G2等分裂間期的癌細胞，且M期持續時間短，分裂后的細胞很快轉入下一期，鏡下觀察到的M期癌細胞數量遠小于Ki67陽性癌細胞，故核分裂指數受調控影響的敏感性低于Ki67增殖指數。為了具有直觀體現干預效果的指標以分析MLT對乳腺癌腫瘤生長的影響，本研究除腫瘤細胞增殖指數、核分裂指數等腫瘤生長微觀參數外，還以腫瘤體積作為宏觀生長指標評估MLT對大鼠乳腺癌的影響。本研究結果從直觀角度反映出補充MLT能抑制乳腺癌生長浸潤的范圍，與MLT對乳腺癌細胞Ki67增殖指數的影響效果基本一致，表明MLT通過影響乳腺癌細胞周期抑制癌細胞增殖活性，能最終抑制乳腺癌的腫瘤生長。Jardim-Perassi等〔14〕在人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中的研究表明，經MLT治療后，乳腺癌腫瘤體積比無MLT治療的對照組明顯縮小；對腫瘤組織的研究表明，MLT治療后的乳腺癌中血管內皮生長因子受體(VEGFR)-2表達及腫瘤間質微血管密度均明顯低于對照組，MLT抑制乳腺癌間質微血管生成，降低乳腺癌組織的血液供應和營養支持，是拮抗乳腺癌腫瘤生長，使腫瘤體積縮小的重要因素。本研究進一步增加MLT的補充劑量對腫瘤體積未見顯著影響，表現在Ki67增殖指數上的劑量依賴性未能出現在腫瘤體積指標上。而Jardim-Perassi等〔14〕研究則表明增加MLT補充劑量能進一步有效降低乳腺癌腫瘤體積，但較大的MLT補充劑量卻導致荷乳腺癌裸鼠出現明顯的體重降低和死亡率上升。有關MLT補充劑量的研究有待繼續探討，增加MLT補充劑量對腫瘤生長是進一步抑制或是產生其他作用尚未明確，根據療效和副作用選擇合適的補充劑量是MLT治療乳腺癌的重要研究方向。