補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜模型小鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響

李 琳 丁云錄 張蓮珠 張明天 初洪波 牛春風(fēng)

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

特發(fā)性血小板減少性紫癜是血液系統(tǒng)常見(jiàn)病，發(fā)病率逐年增高，西醫(yī)主要以糖皮質(zhì)激素與免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合治療，存在療效差，病情反復(fù)，副作用大的缺點(diǎn)，中成藥在治療該疾病時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯，標(biāo)本同治〔1～4〕。補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒是以氣陰兩虛理論為指導(dǎo)，以人參為基源研發(fā)的用于特發(fā)性血小板減少性紫癜治療的中藥復(fù)方制劑，臨床應(yīng)用療效極佳。本研究主要觀察補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜模型小鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 BALB/c小鼠，18～22 g，雌雄各半。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2011-0004，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。藥品及試劑：補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒，性狀：棕褐色顆粒，批號(hào)：20141201，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)植物化學(xué)研究中心提供。豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，北京西苑醫(yī)院血液病研究室提供。歸脾丸，規(guī)格：200丸/瓶，每8丸相當(dāng)于原生藥3 g，批號(hào)：160209，仲景宛西制藥股份有限公司產(chǎn)品。滅菌注射用水，規(guī)格：2 ml/支，批號(hào)：1605418，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司。紅細(xì)胞裂解液、同型對(duì)照抗體、分化簇(CD)3-多甲藻黃素葉綠素蛋白(PercP)、CD4-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD8-藻紅蛋白(PE)、CD61-PE(美國(guó)BD)。儀器及器材：一次性使用人體靜脈血樣采集容器，規(guī)格2 ml/支，批號(hào)：20161008，河北祥遠(yuǎn)醫(yī)療器械股份有限公司。流式細(xì)胞儀，型號(hào):FACS ARIA Ⅱ，美國(guó)BD公司。倒置熒光顯微鏡，型號(hào):IX71，日本OLYMPUS，超純水器，型號(hào):Mili Q，美國(guó)Millipore。離心機(jī)，型號(hào):LD5-2B，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司。電子天平，型號(hào):BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。恒溫磁力攪拌器，型號(hào):JB-3A，雷茲互感器(上海)有限公司。

1.2動(dòng)物造模與分組〔5～9〕特發(fā)性血小板減少性紫癜模型小鼠：將BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性組(歸脾丸3.5 g/kg)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒12 g/kg、6 g/kg、3 g/kg 3個(gè)劑量組。于第1，3，5，7，9，11天分別腹腔注射1∶6 GP-APS，每只0.1 ml(對(duì)照組注射0.1 ml蒸餾水)。給藥，從第1次注射后開(kāi)始灌胃至造模后第14天。每2天稱重1次，以調(diào)整給藥量。

1.3淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取小鼠乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝全血100 μl至流式管中，空白對(duì)照管不加熒光抗體，同型對(duì)照管加入同型對(duì)照熒光抗體，樣品管加入熒光標(biāo)記的抗體CD3-PercP、CD4-FITC、CD8-PE，混勻，室溫避光孵育 20 min；取出試管，每管加入2 ml 1倍紅細(xì)胞裂解液，立即輕輕渦旋混勻，室溫避光孵育15 min，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液；每管加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml洗滌，渦旋混勻，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，每管加0.5 ml PBS，混勻，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組淋巴細(xì)胞亞群統(tǒng)計(jì)結(jié)果 與模型組比較，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒6 g/kg和3 g/kg組CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)，而CD4+/CD8+比值顯著提高(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2不同性別小鼠淋巴細(xì)胞亞群統(tǒng)計(jì)結(jié)果 與對(duì)照組比較，雌性小鼠模型組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01，P<0.05)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒12 g/kg和6 g/kg有增加雌性小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性。雄性小鼠模型組CD3+、CD8+T 細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，與模型組比較，雄性小鼠補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒6 g/kg可明顯降低CD3+、CD4+T 細(xì)胞數(shù)量(P<0.01，P<0.05)。與模型組比較，雄性小鼠補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒6 g/kg及3 g/kg組CD8+T細(xì)胞顯著降低，CD4+/CD8+比值顯著升高(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的影響

與模型組比較：1)P<0.01

表2 各組不同性別小鼠淋巴細(xì)胞亞群的變化

與模型組比較：1)P<0.05；2)P<0.01

3 討 論

正常機(jī)體中各T淋巴細(xì)胞亞群相互作用，維持著機(jī)體的正常免疫功能。當(dāng)不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，機(jī)體就可導(dǎo)致免疫紊亂并發(fā)生一系列的病理變化〔10,11〕。CD4+T 細(xì)胞即輔助T 細(xì)胞，具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，也有部分細(xì)胞具有免疫抑制和細(xì)胞毒作用；CD8+T 細(xì)胞即細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，具有細(xì)胞毒作用，能夠特異殺傷靶細(xì)胞〔12,13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒具有維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定的作用，當(dāng)機(jī)體T細(xì)胞數(shù)量異常減少時(shí)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒能夠溫和地增加T細(xì)胞數(shù)量，反之，當(dāng)機(jī)體中T細(xì)胞數(shù)量異常增多時(shí)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰顆粒又可以減少T細(xì)胞數(shù)量，從而使機(jī)體處于相對(duì)穩(wěn)定的免疫狀態(tài)。