海爾福干預對鋁暴露大鼠海馬組織阿爾茨海默病相關蛋白表達的影響

李根亮 李 韜 胡紅柳 許苡僥 謝孟林

(右江民族醫學院，廣西 百色 533000)

鋁會大量存在于腦神經纖維纏結(NFT)并引起阿爾茨海默病(AD)〔1〕。AD治療上西醫主要采用乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑、自由基清除劑及抗氧化劑、干預tau蛋白磷酸化等藥物，但因不良反應明顯或價格昂貴，患者難以堅持用藥。中醫中藥在治療AD方面由于不良反應少、成本低廉而日益受到重視。研究中藥治療AD的分子機制，并通過干預老年斑(SP)、NFT的形成，尋找療效明確、副作用少的中藥，具有十分重要的意義。海爾福口服液為復方制劑(茯苓、甘草、薏仁、金銀花等)。海爾福能改善鋁致癡呆動物模型的學習記憶能力和保護腦神經等，但其作用機制還不清楚〔2〕。本研究分析AD大鼠海馬組織勻漿中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42、AchE、總tau蛋白(T-tau)及糖原合酶激酶(GSK)-3β的含量或活性的變化，以闡明海爾福干預AD形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 AlCl3·6H2O(廣東西隴化工有限公司)，T-SOD、Aβ1～42、AchE、T-tau及GSK-3β試劑盒(南京建成生物工程研究所)，海爾福口服液由右江民族醫學院張樹球教授惠贈。

1.2動物分組及處理 鼠齡10個月的健康清潔級雄性SD大鼠18只，體重(250±10)g，購自右江民族醫學院實驗動物中心。大鼠分組和飼喂參考李根亮等〔3〕方法。隨機分為對照組、鋁暴露組、海爾福干預組，每組6只。每天正常飼喂大鼠普通飼料。對照組正常給水，鋁暴露組和海爾福干預組隔日交替給予添加AlCl3的水和不添加AlCl3的水。海爾福干預組與鋁暴露組不同的是在不添加AlCl3水中添加海爾福口服液。水中AlCl3和海爾福口服液的濃度根據每日大鼠需水量控制，其中AlCl3劑量為280 mg·kg-1·d-1，海爾福口服液劑量為0.8 ml·kg-1·d-1。飼喂6個月。

1.3大鼠海馬組織生化指標檢測 飼喂6個月后，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠進行解剖，取海馬組織加4℃預冷的生理鹽水，低溫勻漿，按照各試劑盒使用說明書，離心取海馬組織勻漿的上清液，檢測海馬組織T-SOD活性及Aβ1～42、AchE、T-tau、GSK-3β含量。

1.4統計分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析，多重比較用最小顯著差數法。

2 結 果

2.1海馬組織中T-SOD活性 與對照組相比，鋁暴露組海馬組織中T-SOD活性極顯著下降(P<0.01)；海爾福干預組與對照組無顯著差異，而與鋁暴露組存在極顯著差異(P<0.01)。見表1。

表1 各組海馬組織中T-SOD、AchE、Aβ1～42、T-tau、GSK-3β含量比較

與對照組比較:1)P<0.01；與鋁暴露組比較:2)P<0.01

2.2海馬組織Aβ1～42含量及AchE活性 與對照組相比，鋁暴露組海馬組織Aβ1～42含量及AchE活性顯著升高(P<0.01)；但海爾福干預組則與對照組無顯著差異，而與鋁暴露組存在顯著差異(P<0.01)。見表1。

2.3海馬組織中T-tau及GSK-3β含量 與對照組相比，鋁暴露組海馬組織T-tau及GSK-3β含量都極顯著升高(P<0.01)，海爾福干預組海馬組織中T-tau及GSK-3β含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，而與鋁暴露組差異極顯著(P<0.01)。見表1。

3 討 論

AD的發病機制可能是多方面的，涉及的蛋白(酶)分子也特別多，如T-SOD、Aβ1～42、AchE、T-tau及GSK-3β等〔4～8〕，但迄今尚沒有定論。SOD是一種能清除機體內超氧自由基的抗氧化酶，也具有防止Aβ對中樞神經細胞產生神經毒性的作用〔4〕。超氧自由基能破壞細胞膜，產生SP等；超氧自由基侵蝕腦細胞則可能使人易患AD；超氧自由基還能通過攻擊正在復制的基因而引起基因突變。因此，SOD在減少超氧自由基對機體組織造成的損傷從而預防腦功能識別障礙中發揮著重要的作用〔9,10〕。AchE則具有通過神經再生修復受損神經的功能，但AchE的大量積累則會引起行動遲緩〔5〕。如直接注射AchE到黑質內的大鼠會表現行動遲緩和木僵狀態。Aβ生理情況下是低濃度的，因而是無神經毒性的。但病理狀態下，大量表達的Aβ在神經組織中沉積形成SP，并通過激活GSK-3β來磷酸化tau蛋白產生神經毒性〔6〕。Aβ沉積通常由β-淀粉樣前體蛋白(APP)基因突變或異常剪切引起〔7,11〕。APP基因存在多個轉錄起始位點，因此該基因可能通過基因的不同編輯和不同剪切方式產生不同亞型。在正常腦組織中表達的亞型雖然有多種，但主要是APP695；而AD患者的腦中則出現不同亞型比例失衡的現象，生成大量的Aβ1～42。tau蛋白是一種在多種生物體內廣泛存在的微管相關蛋白家族(MAP)成員。人類神經元中表達的tau蛋白與神經細胞微管組裝、穩定及物質傳遞相關。tau蛋白的活性受磷酸化和脫磷酸化調節，過度磷酸化會導致微管解聚及tau蛋白異常聚集形成NFT，在神經元內形成異常的細胞骨架，影響神經系統的功能〔8〕。導致tau蛋白過度磷酸化的機制雖然還不清楚，但大量的實驗表明，AD腦中蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性調節失衡，是使tau蛋白過度磷酸化的重要因素。GSK-3β是目前研究比較多的、也是最有效的磷酸化tau蛋白激酶之一〔6,12〕。因此某些因素異常導致的GSK-3β過表達會顯著增加海馬組織細胞內tau蛋白的磷酸化水平。

由于T-SOD能夠通過減少機體內的超氧自由基來防止后者對機體的損傷，因此海馬組織中T-SOD活性的下降說明大鼠海馬組織清除超氧自由基的能力下降，超氧自由基可能在一定程度上損傷了海馬組織。過量的超氧自由基不僅損傷海馬組織細胞，還可能破壞DNA結構引起基因突變。Aβ1～42含量的增加則說明大鼠海馬組織中有Aβ1～42沉積，即此時的海馬組織內可能有SP形成，同時也說明海馬組織中GSK-3β活性可能有所上升。AchE活性上升則說明海馬組織由于受到損傷而通過神經再生對海馬組織進行損傷修復，但大量的AchE則使大鼠行動遲緩。T-tau含量增加一方面來自于磷酸化tau蛋白(p-tau)的增加，另一方面則來自于非磷酸化的tau蛋白增加，前者的增加與GSK-3β含量升高相一致，后者的增加則為GSK-3β的激酶活性提供底物，以保證p-tau大量生成。這一結果說明，鋁暴露大鼠的海馬組織內可能由于p-tau的增加而產生了NFT。

由此推測，鋁致AD的可能分子機制：(1)鋁在機體組織內積累引起了海馬組織內T-SOD活性(含量)降低及APP基因編輯和剪切方式的改變；(2)T-SOD活性(含量)降低導致海馬組織中超氧自由基濃度的上升，從而損傷海馬組織內的神經元(包括細胞體及突起)，并可能引起APP基因的變異從而導致Aβ1～42含量增加；(3)APP基因突變及剪接方式改變則引起海馬組織Aβ不同亞型表達比例失衡，Aβ1～42大量生成；(4)神經組織的損傷誘發AchE活性(含量)的自我保護性增加以修復受損的神經組織，從而產生大量的NFT；(5)Aβ1～42含量增加導致SP的形成并大量激活GSK-3β，后者對tau蛋白進行磷酸化生成更多SP，受損神經組織的大量修復同樣可能產生NFT；(6)海馬組織SP和NFT大量生成導致AD；(7)tau蛋白大量磷酸化則使組織細胞連續產生非磷酸化tau蛋白以滿足細胞的正常需求，這本質上又為GSK-3β提供了催化底物，非磷酸化的tau蛋白的不斷產生和p-tau大量積累引起T-tau含量的異常增加。見圖1。

X，海爾福干預位點圖1 鋁致AD的可能分子機制

本文表明，海爾福干預鋁致AD的可能分子機制是通過降低鋁在機體組織內的積累防止海馬組織內T-SOD活性(含量)降低、APP基因的異常編輯和剪切及APP基因的可能變異，從而防止海馬組織的損傷及Aβ1～42含量增加。由于沒有神經組織的顯著損傷，因而不會誘發海馬組織內AchE活性的自我保護性增加以修復受損的神經組織及NFT的生成。沒有Aβ1～42含量的顯著增加則不會導致SP形成及GSK-3β含量顯著升高，因此tau蛋白不會被過度磷酸化而產生更多的SP，T-tau含量也不會異常增加。