GREB1基因多態性與老年骨質疏松性骨折的相關性研究

鄭繁榮 呂鵬飛 唐沖 侯曉飛 張昆 劉正 張清華 栗劍 張光武

北京大學首鋼醫院骨科，北京 100144

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的特征表現為骨量降低，骨微結構破壞，骨強度下降及骨折風險增加[1]。骨質疏松癥包括原發性骨質疏松癥和繼發性骨質疏松癥。原發性OP分為絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)、老年骨質疏松癥(senile osteoporosis，SOP)和特發性骨質疏松癥(idiopathic osteoporosis，IOP)。其中SOP為70歲以后發生的骨質疏松癥，又稱為Ⅱ型骨質疏松癥。人口老齡化已出現在全球許多國家，我國亦不例外。相關資料顯示，2014年，中國60歲上的老年人口已突破2億，預計到2050年左右老年人口將達到全國人口總數的1/3。而相關資料統計顯示，SOP及其引發的骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OF)數量高于心腦血管病及乳腺癌的總和。SOP除了危害老年人的身體健康之外，還嚴重影響其心理，造成嚴重的經濟負擔和社會負擔，故全社會應高度重視SOP及其引發的問題。

研究SOP的相關機制對預防SOP及OF的發生具有重要意義。SOP及OF的發生由遺傳因素和環境因素共同作用所致，其中遺傳因素決定了60%～80%的峰值骨量。自Morrison等[2]于1994年首次提出應用維生素D受體等位基因預測骨密度(bone mineral density，BMD)之后，各國學者相繼發現許多其他候選基因。Hegarty等[3]于近期發現乳腺癌雌激素調控基因1(growth regulation by estrogen in breast cancer 1，GREB1)的基因多態性與高加索人群骨密度相關，而目前國內尚未有針對該基因與骨量或骨折風險的相關性研究。故本文就GREB1基因rs10929757、rs5020877位點多態性與SOP的相關性進行研究，對該基因與OF風險的相關性進行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1一般資料：研究對象來自 2016 年1月至2017 年7月北京大學首鋼醫院骨科病房、老年干部病房的226例患者。骨折組(骨質疏松性骨折)100例，均為椎體骨折患者，其中男性37例，女性63例；年齡70～94歲，平均(76.190±5.208)歲。對照組(無骨質疏松同時無骨折)126例，其中男性46例，女性80例；年齡70～90歲，平均(75.318±4.300)歲。本研究通過醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2納入標準：根據原發性骨質疏松癥診療指南，腰椎或髖部1處及以上部位T≤-2.5SD則定義為骨質疏松。T≤-2.5SD且發生骨折的患者為骨折組。腰椎或髖部所有部位T均>-2.5SD的患者為對照組，兩組患者年齡≥70歲；理解本研究的目的及要求并簽署知情同意書。

1.1.3排除標準：伴隨嚴重合并癥；合并影響骨代謝疾病，包括甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退、垂體疾病等；近1年應用雙膦酸鹽類藥物；近6個月使用影響骨代謝藥物，包括骨化三醇、雌激素、活性維生素D、降鈣素、類固醇激素等。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度測定：受試者取仰臥位，應用雙能X線骨密度儀(QDR-4500；Hologic，Inc.，Waltham，MA，USA)測量髖部和腰椎骨密度值。

1.2.2SNP分型：所有患者清晨空腹時采集靜脈血2 mL，置于EDTA 抗凝管中，存于-80 ℃冰箱等待提取DNA。外周血白細胞DNA提取采用酚/氯仿法，提取后存于-20 ℃冰箱。IGF-1基因rs2229765、rs35767位點引物由上海生物工程技術有限公司合成。rs10929757位點上游引物：5′-GCATCTAGGTGGTAGCCGAG-3′，下游引物：5′-GCTCACACCTCAGGGAAAGC-3′；rs5020877位點上游引物：5′-TCTCTCTTTCAGGAGCACTTTC-3′，下游引物：5′-AGAAAGATTCAGCCTTTCCTCT-3′。應用Snapshot技術進行基因分型。核心反應體系包擴測序酶、熒光標記的 ddNTP、緊挨多態位點5′-端不同長度的延伸引物、包含SNP位點的PCR產物模板。通過反應，引物延伸一個堿基即終止，再經測序儀檢測，根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組患者的基本情況

兩組研究對象在性別、年齡和體質量指數上差異無統計學意義(P>0.05)。兩組各部位BMD值比較，骨折組均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較

2.2 兩組患者在rs10929757位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為49.0%、51.0%，對照組C、A等位基因頻率分別為51.6%、48.4%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為23.0%、52.0%、25.0%，對照組CC、CA、AA基因型頻率分別為23.8%、55.6%、20.6%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 兩組男性患者在rs10929757位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組男性患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為36.5%、63.5%，對照組C、A等位基因頻率分別為52.2%、47.8%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為13.5%、45.9%、40.5%，對照組CC、CA、AA基因型頻率分別為28.3%、47.8%、23.9%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 兩組女性患者在rs10929757位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組女性患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組C、A等位基因頻率分別為56.3%、43.7%，對照組C、A等位基因頻率分別為51.2%、48.8%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。骨折組CC、CA、AA基因型頻率分別為28.6%、55.6%、15.9%，對照組CC、CA、AA基因型頻率分別為21.3%、60.0%、18.8%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 兩組患者在rs5020877位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為6.9%、93.1%，對照組G、A等位基因頻率分別為6.3%、93.7%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。由于GG基因型僅有1例，且GA型少于AA型，故將GG型與GA型合并計算。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為12.0%、88.0%，對照組GG+GA、AA基因型頻率分別為11.9%、88.1%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 兩組男性患者在rs5020877位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組男性患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為10.1%、89.9%，對照組G、A等位基因頻率分別為7.0%、93.0%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為16.2%、83.8%，對照組GG+GA、AA基因型頻率分別為13.0%、87.0%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.7 兩組女性患者在rs5020877位點等位基因頻率和基因型頻率比較

兩組女性患者等位基因和基因型均符合遺傳學Hardy-Weinberg定律(P>0.1)。骨折組G、A等位基因頻率分別為5.0%、95.0%，對照組G、A等位基因頻率分別為6.0%、94.0%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。骨折組GG+GA、AA基因型頻率分別為9.5%、90.5%，對照組GG+GA、AA基因型頻率分別為11.3%、88.7%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.8 rs10929757位點不同基因型患者骨密度比較

在rs10929757位點，總體、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.9 rs5020877位點不同基因型患者骨密度比較

在rs5020877位點，總體、男性和女性患者中不同基因型患者骨密度值比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 rs10929757位點不同基因型患者骨密度比較(g/cm2)

表3 rs5020877位點不同基因型患者骨密度比較(g/cm2)

3 討論

據估計，2010年中國在OF的花費接近100億美元，預計2035年增加1倍，而2050年將達到254億美元[4]。并且OF患者術后仍有較高的再骨折風險[5]。因此，應積極研究OP和OF的發生機制，并對其危險因素進行干預，以降低OF造成的相關醫療費用。種族、高齡、絕經后女性、OF家族史為OP的不可控危險因素，不健康的生活方式、體質量指數過低等為可控危險因素。為盡可能減少混雜因素干擾，本研究納入患者年齡均大于70歲，并人為控制性別比例及體質量指數，使兩組研究對象具有可比性。臨床上將BMD檢查作為診斷OP的金標準，已有大量研究證實了相關基因與BMD的相關性[6-7]。故本研究以BMD檢查結果分組，將全身1處及以上部位出現T≤-2.5SD且發生骨折的患者定為骨折組，將全身無1處部位出現T≤-2.5SD且無骨折的患者定為對照組。

國內外許多研究顯示，女性在絕經后發生OP及OF的風險隨絕經年限增加而呈現出明顯增高的趨勢[8-9]。雌激素水平是女性BMD的主要影響因素。正常女性BMD在30歲左右達到峰值，在圍絕經期平緩下降；而在絕經后，由于雌激素水平明顯降低，使得成骨細胞活性絕對下降，破骨細胞活性相對增強，于是血鈣水平明顯增加。在負反饋作用下，甲狀旁腺激素的分泌受到抑制。由于維生素 D 的內分泌系統主要受甲狀旁腺激素調節，故維生素 D的合成隨之受到影響[10-11]。而維生素D作為影響鈣離子吸收的因素之一[12]，其降低將造成鈣離子在消化道內吸收減少，進一步造成骨形成減少，骨吸收增加，導致BMD迅速下降。隨著絕經年限的增加，機體各臟器功能亦逐漸減弱，細胞衰老造成雌激素分泌逐年減少，進一步減少維生素D和鈣離子的吸收，骨吸收和骨形成失衡愈發顯著，發生OF的概率隨即增加[13]。因此，鑒于絕經后女性為OP的獨立危險因素，本研究亦根據性別進行了亞組分析。

GREB1基因是一種激素反應性基因，亦為雄激素、雌激素信號通路中常見的靶基因[14]。該基因定位于2p25.1，由雌激素誘導產生作用，并直接由雌激素受體調控其表達[15]。在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，GREB1的表達與月經周期內的雌激素水平密切相關[16]。GREB1基因的cDNA有至少3個不同的非編碼5’端外顯子，而這些外顯子的轉錄依賴雌激素的調控，提示存在多個雌激素誘導型啟動子。GREB1亦可調控雄激素，雄激素受體反應元件又可促進GREB1的表達，而抑制GREB1可阻斷雄激素所誘導的組織生長[17]。雌激素和雄激素都可調節骨重建使骨結構保持完整。

Hegarty等[3]對477個無血緣關系的絕經后女性的研究發現，在rs10929757位點，A等位基因頻率為38%，A等位基因攜帶者具有更高的股骨頸部BMD值。本研究中，在rs10929757位點，在總研究對象中和男性人群中，發現骨折組A等位基因頻率均大于對照組。此外，在兩組男性患者的比較中，骨折組為63.5%，對照組為47.8%，差異具有統計學意義(P<0.05)。兩組患者在總體和各亞組中各基因型比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在總體、男性和女性患者中分別比較該位點不同基因型患者BMD值，發現男性A等位基因攜帶者具有更低的全髖部和腰椎部BMD值，而女性A等位基因攜帶者具有更高的全髖部BMD值，女性AA型具有更高的腰椎BMD值，但以上結果均無明顯差異，這可能與樣本量少有關。本研究說明老年男性在rs10929757位點A等位基因攜帶者椎體OF風險更高，該基因位點多態性存在性別差異和種族差異。

Hegarty等[3]同時對來自229個家庭的508個成員的研究發現，在rs5020877位點，G等位基因頻率為9%，G等位基因攜帶者具有更高的腰椎和股骨頸部BMD值。本研究中除男性骨折組的G等位基因頻率(10.1%)以外，其余均低于Hegarty研究的結果。兩組患者在總體和亞組中GG、GA基因型和AA型的比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在總體、男性和女性患者中分別比較該位點不同基因型患者BMD值，發現G等位基因攜帶者無論男女均具有較高的髖部BMD值，女性G等位基因攜帶者具有更高的腰椎BMD值，但差異均無統計學意義(P>0.05)，增加樣本量可能出現顯著區別。因此，本研究未發現rs5020877位點基因多態性與老年OF相關。

綜上所述，本研究提示老年男性在rs10929757位點A等位基因攜帶者椎體OF風險更高，未發現rs5020877位點多態性與老年OF的相關性。然而，本研究具有以下局限性：首先，樣本量較小，代表性不足，未能進行家系研究進一步證實相關性，這可能是造成某些陰性結果的原因；其次，未能綜合比較不同骨折類型、合并癥、生活方式、環境以及雌激素水平等因素；此外，GREB1基因影響骨量的分子機制仍需進一步闡明。因此，下一步需擴大樣本量，并進行更廣泛和深入的研究，進一步探討OP的發生機制，為預防OF提供理論基礎。