促排卵過程中累積促性腺激素使用量對后續凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響

劉闖，馬媛，海溧，李博，曹澤磊，馬夜肥，康彬，李麗，王曉紅

(空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038)

促排卵(COH)是體外受精-胚胎移植技術的關鍵步驟之一，其目的是在一個治療周期內獲得多于自然生理過程的卵母細胞數，進而提高累計妊娠率。促性腺激素(Gn)用量的增大可以提高獲卵數，提高累積妊娠率，但是種植率和活產率下降，并且會增加卵巢過度刺激綜合征的發生風險[1-2]。有研究表明，高劑量Gn的使用可能通過影響卵母細胞及胚胎質量和子宮內膜容受性[2-5]進而影響新鮮周期的臨床結局。然而，在凍融胚胎移植(FET)周期中，雖然避免了Gn對子宮內膜的影響，但是既往促排過程中高Gn用量對胚胎產生的影響是否對會影響FET臨床結局，目前尚不明確，因此，本研究回顧性分析我院2016年10月1日至2017年11月30日FET周期的患者臨床資料，探討Gn累積使用量對后續FET周期臨床結局影響，以期能為輔助生殖技術臨床工作提供參考。

資料與方法

一、研究對象與分組

1.研究對象：回顧性分析我院婦產科生殖醫學中心2016年10月1日至2017年11月30日行FET周期的患者臨床資料，最終符合研究條件的治療周期共1 923個(1 856名患者)。

納入標準：(1)取卵次數≤2次；(2)胚胎移植次數≤2，且移植胚胎中至少有一個好的或者中等胚胎。排除標準：(1)因各種因素行胚胎種植前遺傳學診斷/篩查(PGD/PGS)助孕；(2)男方精子畸形率≥99%；(3)移植方式為雙移植；(4)促排卵方案為自然周期或微刺激周期；(5)宮腔粘連或子宮畸形患者；(6)失訪或數據缺失。

2.分組：促排卵過程中使用Gn藥物主要有果納芬(75 U/450 U，默克，瑞士)、普利康(100 U/600 U，默沙東，美國)和麗申寶(75 U，麗珠)，為了便于計算，在臨床工作中將使用量統一折合為75 U/支。根據FET患者人數以及在促排卵周期累積Gn使用量，將研究對象平均分為3組，A組：低劑量組，共572周期，Gn使用量(14.9±2.9)支(3～19支)；B：中等劑量組，共660周期，Gn使用量(24.5±3.2)(20～30支)；C組：高劑量組，共691周期，Gn使用量(44.7±12.9)(31～97支)。

二、治療過程

1.促排卵：促排卵方案為長方案和拮抗劑方案，所用方法同既往研究[6]。當主導卵泡直徑 ≥18 mm時，或至少有3枚卵泡直徑≥17 mm時，根據雌激素水平選擇肌注人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)5 000～10 000 U/艾澤(默克雪蘭諾，意大利)250 μg，34～36 h后B 超引導下行經陰道穿刺取卵手術[7]。

2.體外受精-胚胎培養：根據病史和檢測結果，采用IVF/ICSI技術行體外受精，受精后16～18 h評估受精結果，并將正常受精的合子在胚胎培養箱(COOK)內繼續培養3～6 d。

3.胚胎評估：D3和D5胚胎評估根據中華醫學會生殖醫學分會實驗室學組共識[8]和Istanbul共識[9]，根據胚胎細胞數目、碎片、囊胚的內細胞團和外滋養層細胞將胚胎質量分為三個級別，即優質胚胎、中等質量胚胎和差等胚胎。

4.胚胎凍融：采用玻璃化方法將胚胎冷凍保存，所用冷凍及解凍試劑、Crytop栽桿均來自Kitazato(日本)，具體方法如下[10]：(1)胚胎冷凍：將胚胎/囊胚從培養液CM/BM(COOK，美國)中轉移至平衡液ES中，室溫下靜置5 min，隨后轉入玻璃化冷凍液VS中，60 s以內將胚胎轉移到做好標記的載桿上，迅速投入液氮中并蓋帽保存；(2)胚胎解凍：從液氮中取出栽桿，迅速將裝有胚胎的葉片前端分別置于 TS 液中1 min，DS液3 min，WS1液5 min，WS2液5 min(置于37℃熱板上)，最后轉移至BM液中培養。

5.凍融周期胚胎移植：排卵正常者一般選擇自然周期移植；排卵異常者則采用激素替代周期或使小劑量促性腺激素進行內膜準備。胚胎解凍后存活，則在B超引導下行胚胎移植術，同時進行黃體支持。胚胎移植后15 d檢測血HCG，若HCG陽性，則判斷為生化妊娠，胚胎移植4周后行超聲檢查，可見胎心搏動者為臨床妊娠。

6.變量收集及觀察指標：

(1)記錄患者年齡、體重指數(BMI)、基礎卵泡刺激素(FSH)、基礎抗苗勒氏管激素(AMH)、基礎竇卵泡數、不孕年限、不孕類型、不孕因素、新鮮周期所用促排卵方案及受精方式，凍融周期胚胎移植當日子宮內膜厚度、凍融周期胚胎移植當日子宮內膜厚度及形態、凍融周期移植胚胎的形態及胚胎質量。

(2)觀察指標：以下指標概念參考2009年監測輔助生殖技術國際委員會和世界衛生組織修訂輔助生殖技術術語詞匯表[11]，著床率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數/總移植周期數×100%；異位妊娠率=異位妊娠例數/臨床妊娠例數×100%；流產率=流產例數/臨床妊娠例數×100%；持續妊娠率=目前隨訪中妊娠仍順利進行的患者/臨床妊娠例數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料比較

本研究共納入1 923個FET周期，比較分析3組間患者的一般資料，結果發現A組與B組相比，女方年齡、BMI、基礎FSH和AMH水平均存在統計學差異(P<0.05)；A組與C組相比，女方年齡、BMI及基礎FSH、AMH、AFC、不孕類型以及不孕因素中的男方因素和雙方因素之間均存在統計學差異(P<0.05)；B組和C組相比，女方年齡、BMI、基礎FSH、AMH、不孕年限、不孕類型、不孕因素中的男方因素和雙方因素之間存在統計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

二、促排卵周期中基礎臨床數據比較

在促排卵過程中，3組間的Gn天數和獲卵數相比較，均有統計學差異(P<0.05)，而3組受精方式相比，均無統計學差異(P>0.05)；A組的促排卵方案與B、C兩組比較，均有顯著性差異(P<0.05)；B組與C組相比，短效長方案和長效長方案之間均有顯著性差異(P<0.05)，而兩組間的拮抗劑方案無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 促排卵周期中基礎臨床數據比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

三、FET周期中基礎臨床數據的比較

FET周期中，3組患者的胚胎移植日內膜形態、移植胚胎數、子宮內膜厚度及形態比較均無統計學差異(P>0.05)；A組與B組相比，移植胚胎質量中的優質胚胎和中等胚胎差異均有統計學意義(P<0.05)；A組與C組相比，胚胎類型、移植胚胎質量中的優質胚胎和中等胚胎均有統計學差異(P<0.05)；B組和C組相比，胚胎類型、移植胚胎質量均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

四、FET周期中Gn用量與妊娠結局的單因素分析

FET周期中，3組患者的著床率(54.9%、52.1%、47.4%)和臨床妊娠率(69.1%、66.8%、61.4%)隨著Gn用量的增加，均有逐漸下降的趨勢，且3組之間兩兩比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)；3組間流產率、異位妊娠率及持續妊娠率比較均無統計學差異(P>0.05)(表4)。

表3 FET周期中基礎臨床數據的比較[(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05

表4 FET周期中Gn用量與妊娠結局的單因素分析[(-±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。著床率數據分布為非正態分布，采用Kruskal Wallis秩和檢驗方法分析

五、FET周期中Gn用量與妊娠結局的多因素logistic分析

因患者基線不齊，組間比較存在混雜因素，故進一步采用多因素logistic分析，調整表1、表2和表3中具有統計學差異的混雜因素[10，12-18]，結果顯示，著床率、臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率及持續妊娠率在不同的Gn使用量組別之間的統計學差異消失(P>0.05)(表5)。

六、極高Gn使用劑量組與常規Gn使用劑量組臨床結局分析

表5結果提示，3組間妊娠結局未見統計學差異，但是在單因素分析中，C組的著床率和臨床妊娠率下降，那么，更高Gn累積用量是否對FET的妊娠結局產生影響呢，故本研究進一步利用平滑曲線擬合[19]對Gn用量和妊娠結局進行多因素分析，結果顯示各項指標均隨Gn用量變化而變化，而當Gn用量極高時(≥60支)，妊娠結局發生顯著改變，故以Gn用量60支為截點，把臨床資料分為兩組，常規組(n=1 828)：Gn使用量<60支；極高組(n=95)：Gn使用量≥60支。結果顯示，極高組著床率和臨床妊娠率(39%、50.5%)均低于常規組(52%、66.3%)，采用單因素和多因素logistic分析，均具有統計學差異(P<0.05)(表6、7)。

表5 FET周期中Gn用量與妊娠結局的多因素logistic分析

表6 Gn累積使用量常規組和極高組著床率比較(-±s)

注：與常規組比較，*P<0.05

表7 Gn累積使用量常規組和極高組臨床妊娠率比較[n(%)]

注：與常規組比較，*P<0.05

討 論

本研究中，共納入1 923個FET周期，既往促排卵過程中，在不同劑量Gn使用組之間，高劑量組患者具有較高的年齡、BMI、基礎FSH，較長的不孕年限，且促排卵天數增加，獲卵數減少(表1、2)。主要原因可能與年齡、基礎FSH和卵泡數與患者的卵巢儲備功能相關[22]，進一步影響了促排卵方案的選擇以及Gn使用量[23]。因此，單因素分析結果顯示，高劑量組的著床率和臨床妊娠率降低(P<0.05)，調整混雜因素后，Gn累積使用量的高低與FET周期的臨床結局無相關性(P>0.05)。本研究結果與Munch 等[2]研究結果相同。另外，本研究排除了差等質量胚胎，避免胚胎凍融過程產生的冰晶損傷(胚胎質量越差，冰晶損傷越大[24])，減少了胚胎質量對結局的干擾因素，提高了數據分析的可靠性。

在臨床工作中Gn累積用量可以無限放大嗎，是否存在閾值效應，目前尚未見相關報道。本研究進一步采用平滑曲線擬合對Gn用量和妊娠結局進行分析，結果中發現，當Gn用量大于60支的時，曲線出現了拐點。根據平滑曲線的拐點將臨床資料分為常規組和極高組，通過單因素和多因素logistic分析，結果提示極高組的著床率和臨床妊娠率(39%，50.5%)與常規組相比(52%，66.3%)下降，且具有統計學差異(P<0.05)。同時，考慮到年齡，基礎卵巢功能等混雜因素，進行多因素logistic回歸分析，發現著床率[β=-0.12，95%CI(-0.24，-0.01)]和臨床妊娠[OR=0.52，95%CI(0.30，0.91)]發生率隨Gn用量的增加而下降，提示臨床工作中要對這部分患者人群高度重視。其原因可能是：(1)在常規組(卵巢功能正常)，Gn累積使用量不影響胚胎的染色體非整倍性率[25]，但在極高組，高劑量外源Gn的使用，可能增加染色體非整倍性率風險(Gn累計用量每增加1 000 U，染色體非整倍性率風險增加16.4%[25])；(2)高劑量外源性促性腺激素的使用可能影響卵母細胞成熟和減數分裂過程[26]，干擾卵泡的自然生長發育，從而介導染色體非整倍體和嵌合體的發生；(3)在促排卵過程中，多個卵泡同時發育，體內雌激素逐漸上升，與卵裂球的多核現象相關[27]。因此，極高劑量的Gn使用量，可能通過上述機制影響卵母細胞質量以及胚胎非整倍性率，進一步降低FET周期的臨床結局。然而，本研究為回顧性研究，具有一定的局限性并且結局指標只關注了著床率和臨床妊娠率，我們需要進一步的隨訪，對后期的活產率及妊娠并發癥發生率方面做進一步研究。

綜上所述，促排卵過程中極高劑量Gn(≥4 500 U)的使用，可能導致卵母細胞或胚胎的染色體異常，降低后期FET周期的胚胎著床率和臨床妊娠率，因此，在新鮮周期促排過程中應控制Gn用量在60支之內(<4 500 U)，以改善后續FET周期的妊娠結局。