膽管癌組織中c-Met、Gab1的表達及意義

李志鋒 石榮亞 霍 曼 孫明德 (保定市第一醫(yī)院普外科，河北 保定 071000)

膽管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，多起病隱匿，病情進展迅速，預后差，嚴重威脅人類健康。近年來分子生物學標記物的研究為腫瘤的早期診斷與治療提供了契機。原癌基因c-Met的編碼產(chǎn)物是肝細胞生長因子(HGF)的細胞膜受體，屬酪氨酸激酶受體〔1〕，在細胞內(nèi)信號轉導中發(fā)揮重要作用，Gab蛋白是一類接頭蛋白，該家族蛋白因能與生長因子受體結合蛋白2(Grb2)相結合而得名。Gab1蛋白在Gab家族中含量最多、分布最廣，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔2〕。本研究檢測膽管癌組織及其癌旁組織中 c-Met、Gab1的表達情況，同時探討 c-Met、Gab1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般材料 收集保定市第一醫(yī)院2008年3月至2015年 6月膽管癌標本 52例，年齡 39～72(平均62.8)歲;男29例，女23例;高分化20例，中分化18例，低分化14例;Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例;其中28例有淋巴結轉移，24例無淋巴結轉移;收集30例距膽管癌組織2 cm處經(jīng)病理學證實的非癌膽管組織作為對照組。

1.2 方法 所有標本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。切片脫蠟水化，浸于枸櫞酸鹽緩沖液經(jīng)中火檔微波處理行抗原修復。然后按照嚴格按照SP試劑盒說明、操作流程規(guī)范進行。兔抗人c-Met多克隆抗體和兔抗人Gab1多克隆抗體購自上海研生生物公司，SP免疫組化染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。用已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定 c-Met的陽性染色為胞質出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色為陽性顆粒，Gab1的陽性染色為細胞膜和細胞質中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，每張切片隨機在高倍鏡下(×400)選擇不同的5個視野，每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞，根據(jù)陽性細胞數(shù)量及染色強度，用半定量評分法對實驗結果進行判定:①著色強度:無著色為0分，淡黃色為1分;棕黃色計2分;棕褐色計3分。②陽性細胞數(shù)在計數(shù)細胞中所占百分比:陽性細胞≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩者分值相加:0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(-)，6～7分為強陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 c-Met、Gab1在膽管癌組織中的表達 c-Met在52例膽管癌組織中，40例(76.9%)呈陽性表達;在30例癌旁膽管組織中，4例(13.3%)呈陽性表達。Gab1在52例膽管癌組織中，36例(69.2%)呈陽性表達;在30例癌旁膽管組織中，5例(16.7%)呈陽性表達。c-Met、Gab1在膽管癌組織中的表達均明顯高于在癌旁膽管組織(P＜0.05)。

2.2 膽管癌中c-Met、Gab1表達與臨床病理因素的關系 見表1。

表1 c-Met、Gab1在膽管癌不同臨床病理特征中的表達(n)

c-Met、Gab1在膽管癌組織中免疫組化表達陽性率與患者性別、年齡、分化程度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);c-Met表達陽性率與腫瘤分期、有無淋巴結轉移呈正相關，Gab1表達陽性率與腫瘤分期呈正相關(均 P＜0.05)，Gab1與淋巴結轉移無相關性(P＞0.05)。

2.3 c-Met和 Gab1在膽管癌中相關性 c-Met和Gab1在膽管癌組織中表達呈正相關(r=0.327，P＜0.05)。

3 討論

c-Met是原癌基因c-Met編碼的蛋白質產(chǎn)物，c-Met基因位于人類第7號染色體7q21-q31，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子。c-Met是肝細胞生長因子(HGF)的細胞膜受體，由 1條 50 kD的 α亞基和140 kD的β亞基組成，其中α鏈為胞外部分，β鏈分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，α鏈和β鏈N端的胞外區(qū)作為配體共同參與與配體HGF的結合，而β鏈的C端位于胞質內(nèi)，具有酪氨酸激酶活性。HGF是一種多功能生長因子，HGF可通過誘導有絲分裂和細胞運動，通過各種信號通路促進細胞分化、遷移〔3〕。c-Met在膽管癌中的作用是通過交錯復雜的信號通路完成的，c-Met蛋白與HGF結合后，激活受體胞內(nèi)蛋白激酶結構域中的酪氨酸蛋白激酶(PTK)，受體自身的酪氨酸殘基磷酸化，進而導致多種底物蛋白磷酸化，如磷酯酶 C-γ(PLC-γ)、磷脂酸肌醇 3 激酶 (PI3K)、Gab1、Grb2等含有Src同源區(qū)的分子，引起下游信號通路，如Ras/MAPK，PI3K/Akt和 STAT 等的激活〔4〕，調節(jié)細胞的增殖、分化、運動等多種過程，從而引起腫瘤細胞侵襲性增強和抗凋亡，腫瘤血管生成、增殖，最終發(fā)生轉移。c-Met廣泛表達于人體正常組織，而在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉移過程中有過表達和基因擴增現(xiàn)象〔5，6〕。馬桂芳等〔7〕采用免疫組織化學法、real-time PCR法研究c-Met在胃癌組織中的表達，結果發(fā)現(xiàn)c-Met在胃癌組織中的陽性表達率和c-Met mRNA明顯高于對照組，c-Met蛋白表達與胃癌的淋巴結轉移、臨床TNM分期相關，認為c-Met在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。Kwon等〔8〕通過抑制c-Met介導的信號通路可限制卵巢癌細胞的生長和遷移。

Gab1是Gab蛋白家族的重要成員，Gab1基因定位于人4q31.1染色體上。Gab1具有促進細胞生長和分化、控制凋亡等多種生物學功能。Gab1蛋白位于細胞質中，一旦被受體磷酸化而激活，Gab1蛋白的近氨基端的 PH結構域與胞膜上的三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)相結合，從而把Gab1蛋白招募到細胞膜上，此過程依賴于MAPK對 Gab1蛋白的磷酸化〔9〕。Gab1蛋白與細胞膜的結合增加其與受體分子相互作用的機會及作用持續(xù)時間，保證細胞內(nèi)信號傳遞持久穩(wěn)定。Gab1蛋白可通過自身的 Try627和 Try659結合并激活蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，形成Gab1-SHP2復合物，激活下游Ras-Erk/MAPK信號轉導通路，啟動轉錄及相關蛋白翻譯，促進細胞的增殖、分化〔10〕。Gab1蛋白含有YXXM序列的3個酪氨酸磷酸化位點能夠結合PI3K的p85亞基，這一過程需要 PH結構域與PIP3的相結合。Gab1蛋白與p85亞基結合后激活PI3K，參與調節(jié)PI3K-Akt信號轉導途徑。Gab1蛋白還可與具有YXXP序列的信號分子的 SH2結構域結合等。被Gab1蛋白激活的各個信號轉導途徑之間相互關聯(lián)、互相作用，共同調控細胞的增殖、分化和凋亡等生物學行為。許多原癌基因如 Tpr-Met、gp55及SFFV，可以通過Gab1傳遞信號，Gab1通過參與或上調原癌基因表達，放大與腫瘤生物學行為相關的信號轉導通路。Gab蛋白家族中僅Gab1蛋白含有Met耦聯(lián)序列(MBS)。Gab1蛋白通過MBS直接與HGF受體c-Met相結合而被激活，進而引導c-Met進入細胞核，激活下游信號轉導通路，促使細胞趨化、遷移，實現(xiàn)腫瘤的浸潤、轉移〔11〕。本實驗顯示，c-Met表達與膽管癌分期、有無淋巴結轉移正相關，Gab1表達與膽管癌分期相關。c-Met和Gab1在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有協(xié)同促進作用。