組織轉谷氨酰胺酶2對乙型肝炎相關性肝細胞癌進展的影響

王玉萍 張 娟 (河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450002)

肝細胞癌(HCC)常見的致病因素包括多種病因所致的肝硬化、慢性乙型、丙型肝炎病毒的感染、酗酒、代謝紊亂等，其中在亞洲人群內慢性乙型肝炎病毒感染及其相關的肝硬化是最常見的HCC的致病因素〔1～3〕。盡管對乙型肝炎病毒(HBV)的致病機制的相關研究一直在進行中，但患者最終的生存預后至今仍無顯著改善，具體表現為早期診斷較差及有效治療干預措施缺乏等〔4〕。HCC目前臨床上最常應用的血清標志物為甲胎蛋白(AFP)，但研究顯示將近40%的HCC患者AFP無顯著升高，并且部分AFP顯著升高的患者僅存在肝硬化或HBV感染的活動期，因此尋求一種新型的標志物以提高早期檢測HCC的準確性，有利于后期患者治療的預后改善是十分有必要的。最新的研究嘗試使用cDNA微陣列分析探索基因表達因素與腫瘤侵襲性之間的相關關系，其具有準確性高、針對性強等優勢，同時有研究通過肝癌細胞蛋白定量分析顯示組織轉谷氨酰胺酶(TGM)2具有作為新型組織/血清早期檢測HCC標志物的潛能〔5～7〕，因此本研究中我們使用微陣列分析及免疫組化染色對乙型肝炎相關性HCC的進展與TGM2表達的關系進行初步探討，以對臨床診治及相關研究有所指導及借鑒意義。

1 資料與方法

1.1 患者資料 本研究共納入120例乙型肝炎相關性HCC患者，根據TNM分期研究人群分為Ⅰ～Ⅳ期，每期病例數均為30例。通過標準肝臟穿刺方法獲取組織標本，操作均經我院倫理委員會及患者本人知情同意。

1.2 細胞系 研究中選擇使用人肝癌細胞株HepG2，由于其承載了完整的HBV基因組，并且能夠生成所有的病毒相關蛋白、HBV DNA及Dane顆粒;自中科院細胞研究所獲得BEL7402肝癌細胞系，細胞均培養于含有高葡萄糖改良Eagle氏培養基內(HyClone)，添加10%胎牛血清(Gibco)，37℃，5%CO2。

1.3 方法 取20例HCC組織進行微陳列分析基因表達譜。為了驗證TGM2差異性表達的顯著性，我們對組織標本使用TGM2抗體進行免疫組化染色，若TGM2免疫檢測陽性的細胞超過50%，則定義為TGM2大量表達，初步假設TGM2抑制劑可能作為治療的靶方向，使用5、10、15、20 nmol/L 胱胺作用于 HCC 48 h的腫瘤細胞，觀察HCC的細胞存活率。

1.4 微陣列分析 使用RNA提取試劑盒自原代細胞培養物內提取RNA，并對其質量及完整性進行檢驗;使用Affymetrix公司的U133加2.0陣列表達譜進行分析。按照標準方法進行cDNA的合成、探針標記、雜交及陣列掃描，按照文獻中報道的方法進行基本微陣列數據的可視化及數據過濾〔8〕。使用dCHIP程序進行組間的陣列數據分析比較，建立樣本分組，使用中強度探針對變量進行標準化并作為陣列參數的基準水平，基于模型的表達通過完美匹配/不匹配差分模型進行計算分析。

1.5 免疫組化染色分析 組織標本或細胞使用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)進行固定，之后進行石蠟包埋并按照標準方法步驟進行染色，簡要言之首先使用二甲苯去除石蠟，后對標本進行不同濃度乙醇的脫水，然后使用2%山羊血清進行封閉。隨后樣本與一抗進行過夜孵育(4℃)，室溫下二抗與辣根過氧化物酶(HRP)結合1 h，通過HRP底物實現信號強弱的可視化。一抗包括:多克隆兔抗GFAP(Chemicon International公司)、單克隆鼠抗 EMA(Thermo Scientific)、多克隆兔抗S100和單克隆小鼠抗波形蛋白(Dako公司);TGM2抗體購自Abcam公司;對腫瘤區域至少隨機選擇4個高強度區域(HPF)進行分析，研究者獨立對HPF的細胞進行計數并記錄為%/HPF。

1.6 Western印跡分析 收集腫瘤細胞后使用低溫PBS洗滌2次，后使用RIPA緩沖液進行細胞裂解，獲得的細胞裂解物首先于冰上靜置 30 min，后13 000 r/min離心10 min后再次將沉淀懸浮于含有十二烷基硫酸鈉(SDS)及33%甘油的緩沖液內，獲得的蛋白質通過SDS-聚偏氟乙烯(PVDF)進行分離并轉移至硝酸纖維素膜上(Bio-Rad公司)利用適宜的抗體、HRP結合的二抗及增強化學發光檢測系統(GE，費爾菲爾德)進行Western印跡分析。最后通過GS-800校準密度儀(BioRad公司)對相對表達水平進行定量。

1.7 統計學方法采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 基因表達圖譜 用于微陣列分析的總計20例組織樣本，多變量分析聚類產生的熱圖顯示存在2 552個轉錄的差異性表達;而后通過MATLAB版本(R2013a)使用“＇mafdr＇”指令來計算錯誤發現率(FDR)用于Ⅰ期與Ⅳ期HCC的多重比較檢驗假設，結果顯示與Ⅰ期相比，Ⅳ期時TGM2的基因表達顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 Ⅰ期與Ⅳ期HCC基因表達微陣列分析

2.2 HCC內TGM2的表達 TGM2的大量表達主要見于Ⅲ期(79.8%)及Ⅳ期(91.2%)HCC，顯著高于Ⅰ(23.5%)～Ⅱ期(43.8%)腫瘤組織內的水平(P＜0.05)，提示TGM2的表達可能與腫瘤的侵襲性及病情進展相關。

2.3 抑制TGM2促進細胞死亡 在使用胱胺后48 h后，腫瘤細胞的存活率下降(5，10，15，20 nmol/L 胱胺組存活率分別為63.4%，51.3%，45.6%，36.5%)至最大值的36.5%左右。

3 討論

HBV相關的慢性肝臟病變是HCC的最主要病因之一，據報道若無干預措施其發展成肝硬化的概率可達40%左右，極大地增加了罹患HCC的風險。此類患者的預后很大程度上與早期的診斷及后期的有效治療措施密切相關〔9〕。

TGM2作為多功能酶能夠對轉錄后的蛋白質進行修飾，形成谷氨酰胺和賴氨酸側鏈分子間的異肽鍵，其參與不同的生物作用過程，有研究顯示其在乳糜瀉、神經變性疾患及部分癌癥等中發揮重要作用〔10，11〕。最新的研究亦證實TGM2的表達水平上調與結直腸癌、非小細胞型肺癌、喉癌等癌癥的預后差相關，并且有研究認為其可作為乳腺癌或肺癌化療抵抗的有效標志物，對于腦部神經膠質瘤患者TGM2的表達上調顯著減少患者的生存期〔12〕;而若使用胱胺、葡糖胺或KCC009對TGM2進行抑制則能夠顯著促進神經膠質瘤、乳腺癌或胰腺癌的細胞死亡，同時研究顯示TGM2的表達上調與腫瘤的侵襲性較強相關，因此其可作為治療部分類型癌癥的作用靶點〔13～17〕。

TGM2在諸多組織內可大量表達，并且可存在于細胞的多個區域，包括細胞外基質、細胞膜、細胞質、線粒體及細胞核內，其在細胞生長、分化及凋亡中通過多種作用機制施加負面作用，具體包括轉酰氨基酶、GTP酶、細胞黏附、蛋白質二硫鍵異構酶、激酶和蛋白質折疊等〔18〕。TGM2在腫瘤形成中的具體作用機制目前仍不清楚，但相應的存在幾種機制。有學者認為TGM2可以激活核因子(NF)-κB、局部的黏連激酶(FAK)酪氨酸激酶，進而激活抗細胞凋亡通路，實現腫瘤細胞的永生化〔19〕。若使用 TGM2的抑制劑KCC009可使Akt磷酸化下降而促凋亡蛋白Bim的表達上調，從而使腫瘤組織細胞的細胞凋亡過程顯著增強〔20，21〕。

綜上所述，本研究結果初步證實在HBV相關的HCC組織中TGM2的表達水平與腫瘤的侵襲性及分期相關，通過競爭抑制TGM2的作用通路可促使腫瘤細胞凋亡。