高糖對人視網膜微血管內皮細胞炎癥因子和線粒體功能的影響及津力達聯合通心絡的保護作用

位 庚 邢玉微 申瑞霞 郭會敏 梁俊清 姚 兵 郭志方(石家莊市第二醫院，河北 石家莊 05005)

糖尿病視網膜病變(DR)為糖尿病初期最為嚴重的微血管并發癥之一，主要病理改變是眼底血管結構發生改變，出現微動脈瘤、滲出或新生血管形成;患者視力、視野明顯減退，甚者失明。非增殖期DR通過積極的藥物治療是可以逆轉的，而到出現新生血管等增殖期病變時則無法逆轉。中醫藥治療DR非增殖期療效明顯〔1，2〕。本課題組前期的臨床研究已顯示津力達聯合通心絡對非增殖期DR有較好的療效，但其作用機制尚不明確〔3〕。視網膜微血管由單層內皮細胞組成，本研究分析人視網膜微血管內皮細胞(HRCECs)高糖誘導損傷及津力達(JLD)聯合通心絡(TXL)對該損傷的干預作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HRCECs購自美國Sciencell公司。JLD及TXL藥粉由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供;內皮細胞培養基(ECM)(美國Sciencell公司);細胞計數試劑盒(CCK-8，日本同仁化學研究所);白細胞介素(IL)-6及細胞間黏附分子(ICAM)-1試劑盒(南京建成生物工程研究所);JC-1線粒體膜電位分析試劑盒(美國Cayman公司);細胞色素(Cyt)C抗體(美國Santa Cruz公司);核轉錄因子(NF)-κB p65抗體(美國Abcam公司)。Primo Vert倒置顯微鏡(德國Zeiss公司);Forma371細胞培養箱(美國Thermo Electron公司);SW-CJ-ZFD生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);多功能酶標儀(美國Bio Tek公司);UVP凝膠掃描系統(美國UVP公司);電轉膜儀、半干轉膜儀、垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥物配制 配制JLD及TXL工作液〔4〕。

1.3 細胞分組及處理 取對數生長期HRCECs，胰蛋白酶消化后將細胞接種于直徑為6 cm的細胞培養皿或96孔細胞培養板中，使細胞密度為1.0×105個/ml，培養箱中培養細胞融合至80%用于實驗。細胞被隨機分為以下5組(每組平行設置3～4個復孔)，(1)正常對照組:正常培養的HRCECs棄去原培養基，換為無血清ECM培養基;(2)模型組:正常培養的HRCECs棄去原培養基，換為含30 mmol/L葡萄糖的ECM無血清培養基;(3)JLD組:正常培養的HRCECs棄去原培養基，換為含JLD 200 μg/ml無血清ECM培養基預孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加 JLD 200 μg/ml的無血清 ECM培養基;(4)TXL組:正常培養的HRCECs棄去原培養基，換為含 TXL 100 μg/ml的無血清 ECM培養基預孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加TXL 100 μg/ml的無血清 ECM 培養基;(5)JLD+TXL組:正常培養的HRCECs棄去原培養基，換為含 JLD 200 μg/ml加 TXL 100 μg/ml預孵育 4 h，換為含葡萄糖 30 mmol/L加 JLD 200 μg/ml加 TXL 100 μg/ml的無血清ECM培養基。以上5組細胞處理完畢后置于37℃、5%CO2的培養箱中培養48 h后待檢測。

1.4 CCK-8檢測HRCECs生存活性 接種于96孔細胞培養板的HRCECs按照1.3處理后，吸棄原培養基，每孔加入含CCK-8的無血清ECM培養基100 μl，放入細胞培養箱中繼續孵育1 h后酶標儀檢測450 nm波長處OD值。以各組OD值與正常對照組的比值行統計分析。

1.5 ELISA檢測HRCECs上清液中IL-6和ICAM-1含量 接種于96孔細胞培養板的HRCECs按1.3處理后，收集各組細胞上清液，1.5 ml無菌 EP管中1 000 r/min離心2 min取上清液。ELISA檢測各組細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量，操作嚴格按照說明書。

1.6 JC-1試劑盒測定細胞中線粒體膜電位(MMP)接種于96孔細胞培養板的RCMECs按1.3處理后，JC-1 MMP分析試劑盒測定，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 Western印跡法檢測NF-κB、CytC蛋白表達 接種于直徑為6 cm細胞皿的HRCECs按1.3處理后，生理鹽水沖洗2次，吸棄生理鹽水，培養皿內加入40 μl細胞裂解液于冰上充分裂解20 min，超聲破碎后放入4℃離心機內，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，取2 μl進行蛋白定量后，取等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，約5 h后電泳結束，取下凝膠進行半干轉膜，約1 h后轉膜完成，于封閉液中封閉2 h，一抗孵育，至于搖床上4℃過夜，洗膜后與二抗結合1 h，洗膜后用化學發光法檢測抗體結合區帶，以GAPDH作為內參，將各目的蛋白吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進行統計學分析。

1.8 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析，若方差齊時采用最小顯著差法(LSD)，若方差不齊采用Dunnett T3法。

2 結果

2.1 生存活性 與正常對照組比較，模型組細胞生存活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細胞生存活性均明顯升高(P＜0.01);與JLD組、TXL組比較，JLD+TXL組細胞生存活性明顯升高(P＜0.05)。見表1。

2.2 高糖損傷HRCECs上清液IL-6和ICAM-1含量與正常對照組比較，模型組細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低(P＜0.01);與JLD組比較，JLD+TXL組細胞上清液中IL-6含量明顯降低(P＜0.05)，TXL組及JLD+TXL組ICAM-1含量明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.3 高糖損傷HRCECs MMP 與正常對照組比較，模型組細胞MMP明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，TXL組及JLD+TXL組細胞MMP明顯升高(P＜0.01);與JLD組比較，TXL組、JLD+TXL組細胞MMP明顯升高(P＜0.01)，與TXL組比較，JLD+TXL組細胞MMP明顯升高(P＜0.05)。見表1。

2.4 高糖損傷HRCECs NF-κB、CytC蛋白表達 與正常對照組比較，模型組細胞NF-κB、CytC蛋白表達明顯上調(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細胞NF-κB、CytC蛋白表達明顯下調(P＜0.01);與 JLD 組比較，JLD+TXL 組細胞 NF-κB、CytC蛋白表達明顯下調(P＜0.01)。見表1，圖1。

表1 各組HRCECs生存活性、細胞上清液IL-6、ICAM-1含量、MMP、NF-κB及CytC蛋白表達比較(，n=4)

表1 各組HRCECs生存活性、細胞上清液IL-6、ICAM-1含量、MMP、NF-κB及CytC蛋白表達比較(，n=4)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與JLD組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;與TXL組比較:5)P＜0.05

組別 生存活性(%) IL-6(pg/ml) ICAM-1(pg/ml) MMP NF-κB CytC正常對照組 100.00±2.19 21.49±2.31 140.27±8.59 3.17±0.12 0.14±0.02 0.10±0.05模型組 42.71±9.761) 56.78±5.821) 211.36±11.711) 1.56±0.181) 0.58±0.041) 0.31±0.071)JLD 組 63.99±4.322) 46.98±2.542) 187.13±6.272) 1.80±0.08 0.38±0.052) 0.23±0.062)TXL 組 65.68±4.452) 42.98±5.462) 163.67±10.032)3) 2.07±0.202)3) 0.32±0.052) 0.16±0.042)JLD+TXL 組 74.33±3.722)4)5) 39.55±3.792)4) 157.12±12.022)3) 2.53±0.192)3)5) 0.26±0.032)3) 0.12±0.042)3)

圖1 各組HRCECs NF-κB、CytC蛋白表達

3 討論

吳以嶺院士創建的脈絡學說指導從“脾”論治消渴(糖尿病)，提出“運脾津、通脾絡”的消渴新治法，其治療的代表藥物為JLD顆粒和TXL膠囊〔5〕。已有實驗研究將JLD聯合TXL用于保護胰島微血管內皮細胞，結果顯示其保護機制與減輕氧化應激反應有關〔4〕。亦有臨床研究顯示JLD顆粒聯合TXL膠囊能有效降低糖尿病腎病患者尿蛋白、改善腎功能〔6〕。視網膜血管屬于微血管范疇，屬中醫學“絡脈”，而視網膜微血管的病變則屬“絡病”范疇。胰島微血管、腎臟微血管與視網膜微血管同為微血管。

DR為糖尿病的常見并發癥，已成為主要致盲眼病之一。近年實驗研究發現，DR的發生發展過程中炎癥起到了重要的作用，該觀點的提出為治療DR提供了新方向〔7〕。NF-κB是細胞內調節炎癥信號轉導的關鍵因子之一，能夠調控包括IL-6和ICAM-1在內的多種炎癥細胞因子的基因轉錄表達〔8〕。IL-6作為前炎癥因子，在炎癥反應中起著重要的作用〔9〕。IL-6可上調內皮細胞ICAM-1等的表達〔10〕。生存活性的提高是保證血管內皮細胞發揮正常功能的基礎條件。本文中高糖誘導的HRCECs中NF-κB蛋白表達明顯上調，表明細胞內炎癥調節因子被激活，產生了炎癥反應。被NF-κB蛋白調控的炎癥因子IL-6和ICAM-1，經高糖損傷后其細胞上清液中同樣表現出含量增加的趨勢，JLD和TXL均能提高高糖損傷的HRCECs生存活性、抑制高糖引起的炎癥反應，二者聯合使用其效果更優。線粒體存在于大多數細胞中，細胞的有氧呼吸主要在此進行，對細胞受到的損傷較為敏感。已有研究顯示，高糖可損傷內皮細胞的線粒體，是細胞凋亡的機制之一。高糖等損傷因素可使線粒體通透性轉換孔保持持續開放，通透性增加，MMP下降，導致跨膜的氫離子濃度梯度消失，引起呼吸鏈脫耦聯，此時線粒體發生滲透性水腫，外膜破裂，使存在于線粒體內的CytC釋放入胞質〔11〕，導致線粒體內的CytC減少，直接造成了線粒體內呼吸鏈電子傳遞的中斷，抑制氧化磷酸化，促進了氧自由基的生成，繼而ATP含量減少，可最終導致細胞損傷乃至壞死〔12〕。本研究說明JLD聯合TXL可有效逆轉線粒體的損傷狀態。綜上，高糖可誘導HRCECs產生炎癥反應及損傷線粒體功能，JLD聯合TXL可抑制該過程，其作用機制可能與減輕NF-κB的活化，進而減少炎癥因子的釋放及保護線粒體功能有關。