蘭茵鳳揚化濁解毒方治療大鼠潰瘍性結腸炎的作用機制

張 紈 張 晶 曹鵬飛 李 婭 孫建慧 陳天鴿 王彩云 李博林(河北省中醫院，河北 石家莊 0500)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結腸、直腸黏膜和黏膜下層。本病周期長，可多次反復，遷延難愈。UC的發病原因和機制仍有諸多不明，目前多數認為是幾種因素共同影響而引起腸道黏膜免疫功能紊亂所致〔1〕。其中備受矚目的便是以細胞因子介導的諸多信號轉導通路在炎癥性腸病的發病過程中的異常表達〔2〕。中醫藥治療UC顯示出明顯的優勢，濁毒內蘊是UC主病機，化濁解毒法是其基本治法〔3〕。基于以上認識，本研究以UC大鼠為載體，以美沙拉嗪作對照，從δ阿片受體(DOR)-β抑制蛋白(β-arrestin1)-Bcl-2信號轉導通路探討蘭茵鳳揚化濁解毒方治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗動物源自河北醫科大學動物實驗中心〔SCXK(冀)2013-1-003〕，8周齡雄性 Wistar大鼠60只(體重為 200～250 g、清潔級)。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 蘭茵鳳揚化濁解毒方包括佩蘭15 g、茵陳15 g、鳳尾草15 g、飛揚草15 g、藿香12 g、佛手12 g、胡黃連 12 g、石榴皮12 g、白芍 15 g、兒茶6 g、地榆15 g等，上述藥物購自河北省中醫院，由其制劑室制成高、中、低三種濃度混懸液(分別為5.00、2.50、1.25 g/ml)。美沙拉嗪腸溶片(佳木斯鹿靈制藥有限責任公司，生產批號:140308)。2，4，6-三硝基苯磺酸(美國的Sigma公司);總RNA提取試劑(TaKaRa公司，Code No:9108);PCR反應體系(TaKa-Ra公司，Code No:R004A);cDNA合成試劑盒(TaKa-Ra公司，Code No:62120A);DNA標準(TaKaRa公司，Code No:3427A)。PCR擴增儀PE9600型(美國PE公司);高速冷凍離心機(1-15K，美國Sigma);電泳儀、電泳槽(北京六一)。

1.3 動物模型制備〔4〕所有大鼠先適應性飼養2 w，根據隨機數字表隨機劃分為正常組10只和造模組50只。利用TNBS/乙醇法做UC實驗動物模型的準備。模型制備過程中共死亡3只。造模3 d后，從造模組隨機抽取大鼠2只，斷頭處死，予取結腸組織標本處理，確定其標本組織出現了充血、水腫、糜爛及潰瘍形成等病理組織學改變，證明造模成功。

1.4 分組與給藥 造模組大鼠按照隨機數字表分為模型組9只、中藥低、中、高劑量組各9只，美沙拉嗪組9只?？瞻捉M:常規飼養，不予任何干預;模型組:生理鹽水灌胃(4 ml/kg，1次/d);美沙拉嗪組:美沙拉嗪混懸液灌胃(0.3 g/kg，1次/d);中藥低、中、高劑量組:分別給予低、中、高濃度蘭茵鳳揚化濁解毒方混懸液灌胃(5、10、20 g/kg，1 次/d)。連續給藥 2 w。

1.5 標本采集和處理 用藥2 w后，每組大鼠24 h禁食不禁水處理，稱重后，予斷頭處死。在病變最明顯部位(距肛門8 cm處)取2塊1 cm×1 cm標本，生理鹽水沖洗干凈，使無殘留物，用冷凍管封存其中1塊組織并迅速放入液氮中保存，后移入－80℃冰柜保存。另一塊組織予常規石蠟包埋、HE染色處理。

1.6 觀察指標 ①疾病活動指數(DAI)評分:參照文獻〔6〕中的DAI評分標準。DAI=(便血分數+大便性狀分數+體質量下降分數)/3。②結腸黏膜組織病理學觀察。③RT-PCR檢測結腸組織中β-arrestin1、DOR、Bcl-2 mRNA表達情況

1.7 統計學方法 使用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 DAI評分比較 空白組 DAI評分為(0.00±0.00)分;模型組為(2.46±0.43)分，與模型組比較，中藥高、中、低劑量組〔(0.37±0.39)分、(0.81±0.29)分、(1.56±0.41)分〕與美沙拉嗪組〔(0.78±0.29)分〕DAI評分均明顯降低(P＜0.05);其中中藥高劑量組的DAI評分為最低值(P＜0.05);中藥中劑量組與美沙拉嗪組DAI評分無差異(P＞0.05)。

2.2 病理組織學觀察 與空白組比較，其余組大鼠結腸黏膜均有大小不同程度的破壞，如炎性細胞浸潤、腺體結構被破壞，發生組織充血水腫、黏膜糜爛甚或潰瘍等變化。中藥高劑量組結腸黏膜結構基本正常，充血水腫不甚明顯，僅有少量炎性細胞浸潤，與空白組相似。中藥低劑量組黏膜仍有破壞，腺體結構欠規則，較明顯的組織充血水腫，且有不少炎性細胞浸潤，尚可見少量黏膜糜爛及潰瘍。美沙拉嗪組、中藥中劑量組介于兩組之間。

2.3 結腸組織中DOR mRNA與β-arrestin1 mRNA的表達 表1可知，與空白組比較，模型組中大鼠結腸組織的β-arrestin1、DOR mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，各中藥治療組與美沙拉嗪組的β-arrestin1、DOR mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)。中藥高劑量組表達均低于中藥中劑量組、中藥低劑量組、美沙拉嗪組(P＜0.05)。與中藥低劑量組比較，美沙拉嗪組、中藥中劑量組表達水平降低，其差異有統計學意義(P＜0.05)。與中藥中劑量組比較，美沙拉嗪組差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 結腸組織中Bcl-2 mRNA的表達 表1可知，與空白組比較，模型組、中藥中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織中Bcl-2 mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，中藥高劑量組升高無顯著性差異(P＞0.05)。與模型組比較，中藥高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結腸組織中Bcl-2 mRNA表達明顯下降(P＜0.05)。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、美沙拉嗪組Bcl-2 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與中藥中劑量組比較，美沙拉嗪組Bcl-2 mRNA表達下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表達情況()

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表達情況()

與模型組比較:1)P＜0.05;與空白組比較:2)P＜0.05;與中藥高劑量組比較:3)P＜0.05;與中藥中劑量組比較:4)P＜0.05;與中藥低劑量組比較:5)P＜0.05

組別 n DOR mRNA β-arrestin1 mRNA Bcl-2 mRNA空白組 10 0.326 6±0.016 81) 0.320 9±0.018 61) 0.321 7±0.023 01)模型組 9 0.531 9±0.023 82) 0.521 7±0.021 52) 0.525 6±0.027 32)中藥高劑量組 9 0.347 3±0.011 01)2) 0.344 3±0.014 11)2) 0.335 0±0.014 21)3)中藥中劑量組 9 0.391 4±0.024 51)2)3)4) 0.405 2±0.028 91)3)4) 0.379 7±0.023 01)2)中藥低劑量組 9 0.451 5±0.020 91)2)3) 0.453 5±0.026 91)2)3) 0.434 9±0.020 31)2)美沙拉嗪組 9 0.373 3±0.019 11)2)3)4) 0.394 1±0.025 61)2)3)4) 0.357 3±0.010 61)2)4)5)

3 討論

目前，對于UC發生的病因乃至發病機制都不甚清楚。感染、遺傳因素、過敏、氧自由基損傷、免疫異常等均與本病的發生發展有密切聯系。但是在目前臨床觀察中，多數研究認為在其多種發病機制中，免疫異常居于核心地位，而造成免疫異常的關鍵環節就是細胞因子的紊亂，T細胞免疫功能失調所造成的自身免疫異常是UC發生的重要機制。紊亂的細胞因子網絡使T細胞在病損的腸道黏膜及固有層大量聚集，活化的T細胞進一步促使炎癥細胞分泌，致使結直腸的上皮結構廣泛缺失和在固有層發生炎癥改變，細胞因子相互作用造成的腸道炎癥性改變破壞了腸道黏膜穩態，損傷了腸道屏障作用，這些病理性改變與細胞凋亡和細胞壞死密切相關〔6〕，目前細胞凋亡在結直腸黏膜的缺損及糜爛、潰瘍形成中的作用已形成共識〔7〕。越來越多的學者認為感染、遺傳、環境等異?？赡茏鳛槠鹗家蛩貙е履c道微環境改變，從而使腸道菌群突破腸上皮屏障，異?；罨喾N信號轉導通路，進而以T淋巴細胞為主的炎性細胞因子在腸黏膜內大量釋放和聚集，使細胞凋亡抵抗作用加強，腸道免疫穩態遭到破壞，繼而導致UC的發生〔8〕。因此，在UC發生的過程中，異常活化的信號通路及其所致的T淋巴細胞凋亡抵抗發揮著重要作用。

在T淋巴細胞的增殖分化過程中，DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號通路起到主要作用。該通路下游Bcl-2在調控細胞凋亡基因中起到至關重要的作用，是重要的抗凋亡基因，能夠起到抑制細胞凋亡和增殖的作用，Bax是與Bcl-2基因功能完全相反的典型促凋亡蛋白。Bcl-2與Bax分別位于線粒體外膜和線粒體膜，故而其調控凋亡主要作用在線粒體水平，兩者保持相對平衡，一旦比例失衡則會引起T淋巴細胞凋亡缺陷，則可能引起腸道發生慢性炎癥〔9〕。DOR是跨膜G-蛋白耦聯受體(GPCR)廣泛存在于神經及免疫系統。β-arrestin1是一種具有多種生物功能的可溶蛋白質，在GPCR信號通路中作為起始信號分子，發揮負性調節作用。其分布在細胞核和細胞質內，是細胞核和細胞質間的信號傳遞分子，在細胞質內參與GPCR的內化、脫敏，終止GPCR信號通路，參與T淋巴細胞活化過程〔10〕。此外，能夠發揮抗凋亡基因作用的Bcl-2即作為靶基因直接受到β-arrestin1的調控?；罨腄OR信號誘導CD4+T細胞質內的β-arrestin1信號向細胞核內轉移，從而使組蛋白乙?；竝300到p27，與cfos增強啟動子組蛋白H4乙?；虰cl-2基因轉錄活性，促進Bcl-2的表達，從而抑制UC腸道黏膜CD4+T細胞凋亡〔11〕。本實驗結果表明，潰瘍性結腸炎大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號通路異常，存在過度表達的Bcl-2抗凋亡蛋白，CD4+T淋巴細胞在腸道組織中的過度聚集，蘭茵鳳揚化濁解毒方可能通過調控UC大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號通路，從而抑制Bcl-2基因的過度表達，有效減少腸道組織中CD4+T淋巴細胞的過度聚集，從而起到治療UC的目的。

經查閱古籍，中醫本沒有UC的病名，但是根據其典型臨床表現，在中醫病名中，UC可定義為“久痢”、“腸澼”、“休息痢”等疾病范疇。中國古代醫學大家多認為本病乃是起于濕阻，平素飲食礙胃，情志失調皆可為病因。本虛標實，病機錯雜為UC的主要發病特點。但通過長期大量的臨床觀察，可發現本病的基礎病機是濁毒內蘊，也是本病纏綿難愈的關鍵因素。濁毒為病的機制可歸納為“易耗氣傷血、由血入絡，易停滯氣機、膠滯不分，易積累成形、敗壞臟腑”等三易四性的特點〔12〕。本病初期實證居多，濁毒壅結于腸，致氣血搏結，腸絡受損，血癰肉潰化膿，本期當以化濁解毒為主給予治療;后期及緩解期多虛實夾雜證或虛證，在祛除濁毒之邪的同時兼顧補虛。雖然每個階段的治法有異，但以化濁解毒為基礎治法貫穿治療過程的始終。雖然本病病位位屬大腸，但是與脾胃生理功能關系密切。UC在臨床中的典型癥狀以腹痛、腹瀉、里急后重和黏液膿血便為主，常常伴隨體重減輕、嘔吐，偶見關節炎和虹膜睫狀體炎等其他病變。而蘭茵鳳揚化濁解毒方的方義便是以藿香、佩蘭芳香醒脾、脾悅化濁止嘔，調理氣機，鳳尾草味苦性寒涼，有清熱利濕，涼血止血，解毒止痢之功，飛揚草亦酸寒，除清熱解毒利濕，又具收斂之功，四藥合功，共奏化濁解毒之效而為君藥;茵陳本性寒，有清熱利濕的作用，現代藥理研究又因為其揮發油對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等有明顯的抑制作用，故佐助化濁解毒之力;地榆苦寒清熱，入血分而涼血止血，散血熱而療瘡解毒，祛瘀生新，配合烏梅、石榴皮治療赤白下痢，不僅能收斂抗菌，又能抗炎止血，涼血澀腸;仙鶴草苦澀性平，除涼血止血有奇效外，亦能健脾補虛和胃，作健脾止痢之效;白芍調和血氣、緩急止痛;佛手、厚樸理氣則后重自除;兒茶生肌斂瘡。諸藥合用，濁邪化、毒邪清，氣血調和、臟腑有序而諸癥愈。

本研究表明，經蘭茵鳳揚化濁解毒方治療后，大鼠體質量、糞便性狀、黏液膿血便等一般臨床情況均得到有效改善，鏡下結腸黏膜亦得到較好恢復，其中DOR、β-arrestin1及Bcl-2 mRNA在本實驗中的表達水平有明顯下降。因此，蘭茵鳳揚化濁解毒方可能通過調控DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號通路中異?；罨h節的表達，增強腸道黏膜中T細胞的凋亡，恢復腸道免疫穩態而起到治療UC目的。