玉米紫色植株色素對(duì)氟化鈉誘導(dǎo)成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

張 卓 周 波 郭連瑩 王曉紅 于 葉 (沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

氟骨癥是由于長(zhǎng)期攝入過量的氟化物引起氟中毒并累及骨組織的一種慢性侵襲性全身性骨病，是氟中毒的典型癥狀。氟骨癥多發(fā)于青壯年，但以老年患者發(fā)病率高、病情嚴(yán)重〔1〕。研究顯示〔2〕，氟可通過誘導(dǎo)骨組織氧化失衡，進(jìn)而導(dǎo)致骨代謝紊亂，最終引發(fā)氟骨癥。其中，氟誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激抑制成骨細(xì)胞增殖已成為氟骨癥發(fā)生發(fā)展的重要原因之一〔2，3〕。學(xué)者在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察到，外源性抗氧化劑在氟骨癥的防治過程中起積極作用〔4，5〕。玉米紫色植株色素(MPPP)屬于天然花色苷類色素，以矢車菊素-3-葡萄糖苷(45.96%) 和 3 ＇，4 ＇-二 羥 基 花 色 素-3-葡 萄 糖 苷(12.99%)含量最為豐富〔6〕。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MPPP在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的抗氧化活性〔7～9〕，且 MPPP可增強(qiáng)染氟成骨細(xì)胞的增殖能力〔10，11〕，但機(jī)制不詳。本研究以MC3T3-E1成骨細(xì)胞為體外干預(yù)模型，分別觀察MPPP對(duì)過氧化氫(H2O2)和氟化鈉(NaF)所致成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 MPPP(遼寧省東亞種業(yè)有限公司);NaF(Sigma公司);H2O2(Sigma公司);改良型α-MEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司);胎牛血清(FBS，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?;MTT試劑(Sigma公司);總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。BB-15型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heraeus公司);Sonics超聲波破碎儀(美國(guó)SM公司);H-7650透射電鏡(日本日立公司);SPECTRA MAX PLUS 384全光譜掃描儀(美國(guó)MD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1成骨細(xì)胞購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究所。復(fù)蘇后，置于改良型α-MEM培養(yǎng)液(10%FBS)中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.3 主要溶液配制 取MPPP 0.5 g、NaF 0.042 g及H2O20.1 ml分別溶解于10 ml培養(yǎng)液(2%FBS)，0.22 μm膜過濾除菌，濃度均為10－1mol/L。再根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔10，11〕，用相同培養(yǎng)液等倍稀釋至終濃度:MPPP 為 10－7、10－6及 10－5mol/L;NaF 為 10－3mol/L;H2O2為5×10－4mol/L。上述溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞消化后，調(diào)整密度5×104個(gè)，并接種于96孔板(每孔150 μl)。48 h后，換培養(yǎng)液150 μl(2%FBS)，同步化24 h后，吸棄培養(yǎng)液，并分別進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，①H2O2對(duì)MPPP預(yù)處理成骨細(xì)胞的影響:共設(shè)5組，每組8個(gè)復(fù)孔，陰性和陽(yáng)性對(duì)照組均換 150 μl培養(yǎng)液(2%FBS)，低、中、高濃度色素組均更換色素濃度為 10－7、10－6及 10－5mol/L 的培養(yǎng)液 150 μl(2%FBS)，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。于結(jié)束時(shí)間前5 h，吸棄各孔中培養(yǎng)液，陰性對(duì)照孔更換培養(yǎng)液(2%FBS)，其余各孔更換含 H2O2濃度為5×10－4mol/L的培養(yǎng)液(2%FBS)，1 h后磷酸鹽酸緩沖液(PBS)清洗，向各孔中加入 MTT溶液 20 μl(5 mg/ml)，4 h后吸棄空中培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，37℃ 混勻 10 min 后，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)OD值;②MPPP對(duì)染氟成骨細(xì)胞的影響:共設(shè)5組，每組8個(gè)復(fù)孔，分別添加下列培養(yǎng)液150 μl(2%FBS):陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(NaF:10－3mol/L)、低濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－7mol/L)、中濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－6mol/L)和高濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－5mol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h和72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h向各孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中培養(yǎng)液，PBS 小心清洗后，每孔加入 DMSO 150 μl，37℃混勻10 min，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值。

1.5 T-AOC檢測(cè) 細(xì)胞消化后，調(diào)整密度2×104個(gè)，接種于24孔板，每孔1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。吸棄孔中培養(yǎng)液，2%FBS培養(yǎng)液同步化24 h后，將細(xì)胞分為5組，每組4個(gè)復(fù)孔，分別按照1.4中①和②的操作過程添加受試物，并置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)72、48 h后，細(xì)胞消化，PBS清洗，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，4℃超聲破碎，低溫高速離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別測(cè)定各組樣品中蛋白含量和T-AOC。

1.6 透射電鏡標(biāo)本制備 調(diào)整細(xì)胞密度2×104個(gè)，接種于24孔板，每孔1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。吸棄孔中培養(yǎng)液，2%FBS培養(yǎng)液同步化24 h后，將細(xì)胞分為5組，按照1.4中②的操作過程添加受試物，并置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，PBS清洗離心后收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定24 h，沖洗，1%四氧化鋨固定，梯度乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂定向包埋后做超薄切片，經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色后，在HITACHI H-7650透射電鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)MPPP預(yù)處理成骨細(xì)胞增殖的影響 陽(yáng)性對(duì)照組各OD值顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05);MPPP預(yù)處理24和48 h后，低、中、高濃度色素組OD值與陽(yáng)性對(duì)照組比較均無明顯變化(P＞0.05);而MPPP預(yù)處理72 h后，低、高濃度色素組OD值顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 H2O2對(duì)MPPP預(yù)處理的成骨細(xì)胞增殖的影響(，n=8)

表1 H2O2對(duì)MPPP預(yù)處理的成骨細(xì)胞增殖的影響(，n=8)

與陰性對(duì)照組相同培養(yǎng)時(shí)間比較:1)P＜0．05，2)P＜0．01;與陽(yáng)性對(duì)照組相同培養(yǎng)時(shí)間比較:3)P＜0．05

組別 24 h 48 h 72 h陰性對(duì)照組 0．130±0．016 0．146±0．016 0．165±0．010陽(yáng)性對(duì)照組 0．109±0．0072) 0．131±0．0111) 0．141±0．0111)低濃度色素組 0．109±0．0232) 0．137±0．014 0．159±0．0173)中濃度色素組 0．109±0．0112) 0．136±0．013 0．148±0．026高濃度色素組 0．100±0．0132) 0．135±0．013 0．158±0．0253)

2.2 MPPP對(duì)NaF處理成骨細(xì)胞增殖的影響 陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高濃度色素組OD值均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01);48 h高濃度色素組顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.01)，見表 2。

2.3 MPPP對(duì)H2O2和NaF處理成骨細(xì)胞T-AOC的影響 與陰性對(duì)照組(100.00%±5.84%)比較，H2O2可顯著降低陽(yáng)性對(duì)照組(31.21%±4.85%)和低、中、高濃度色素組(36.01%±8.16%、36.42%±15.87%、60.78%±10.70%)成骨細(xì)胞 T-AOC(P＜0.01)，但高濃度色素組成骨細(xì)胞T-AOC明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.01);此外，與陰性對(duì)照組(100.00%±8.69%)比較，NaF可顯著降低陽(yáng)性對(duì)照組(44.11%±8.69%)和低濃度色素組(49.57%±12.47%)成骨細(xì)胞T-AOC(P＜0.01)，但中、高濃度色素組(68.09%±9.29%、88.56%±10.45%)成骨細(xì)胞T-AOC明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.01)。

2.4 MPPP對(duì)染氟成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下觀察，陰性對(duì)照組的成骨細(xì)胞，細(xì)胞核形狀完整、核膜界限清晰、核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較多，可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和糖原顆粒;陽(yáng)性對(duì)照組的成骨細(xì)胞胞質(zhì)成分減少，輕度核固縮，染色質(zhì)濃縮邊集，細(xì)胞內(nèi)廣泛線粒體明顯腫脹，嵴斷裂或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分線粒體腫脹空泡化;而色素干預(yù)條件下的成骨細(xì)胞細(xì)胞器增多，線粒體腫脹程度減弱，細(xì)胞核輪廓清晰，細(xì)胞的病理學(xué)改變減輕。見圖1。

表2 MPPP對(duì)NaF處理的成骨細(xì)胞增殖的影響(，n=8)

表2 MPPP對(duì)NaF處理的成骨細(xì)胞增殖的影響(，n=8)

與陰性對(duì)照組比較:1)P＜0．01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較:2)P＜0．01

組別 24 h 48 h 72 h陰性對(duì)照組 0．188±0．020 0．231±0．006 0．262±0．030陽(yáng)性對(duì)照組 0．155±0．0131) 0．181±0．0131) 0．141±0．0211)低濃度色素組 0．158±0．0081) 0．178±0．0191) 0．160±0．0161)中濃度色素組 0．157±0．0121) 0．189±0．0201) 0．144±0．0201)高濃度色素組 0．159±0．0111)0．197±0．0101)2)0．155±0．0151)

圖1 MPPP對(duì)染氟成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×10 000)

3 討論

在正常的骨代謝過程中，由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分別參與的骨形成和骨吸收始終保持著動(dòng)態(tài)平衡，骨組織處于穩(wěn)定狀態(tài)。此平衡一旦被打破，骨形成和(或)骨吸收作用相對(duì)增強(qiáng)或減弱，即可發(fā)生骨量異常，引發(fā)相應(yīng)的骨代謝疾病〔12〕。特別是在氟中毒狀態(tài)下，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均可呈現(xiàn)不同程度的活躍狀態(tài)〔2，3〕，打破了骨形成和骨吸收作用之間的平衡，最終導(dǎo)致氟骨癥。研究顯示，成骨細(xì)胞對(duì)氟極其敏感，在高劑量氟作用下，其活性受到明顯抑制，成骨作用減弱〔13〕，骨重建失衡，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松或軟化型氟骨癥，而且成骨細(xì)胞抑制與過量氟誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激密切相關(guān)〔3，4〕。體內(nèi)外研究亦證實(shí)〔4，14〕，某些外源性抗氧化劑可清除氟誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，同時(shí)提升組織細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力，進(jìn)而減弱氟對(duì)組織細(xì)胞的氧化損傷。另外，細(xì)胞凋亡是在某種生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞按照自身既定程序自主有序的死亡形式。本研究鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在NaF誘導(dǎo)下，成骨細(xì)胞呈現(xiàn)出核固縮、染色質(zhì)濃縮邊集和廣泛線粒體腫脹等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，而且在抗氧化物質(zhì)MPPP的干預(yù)下，細(xì)胞凋亡程度有所減輕，與多項(xiàng)報(bào)道結(jié)果一致〔3，15〕。可見，高水平氟引起的氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，已成為抑制成骨細(xì)胞增殖的重要原因之一。

MPPP是從新品種玉米的紫色植株中提取，其花色苷類色素含量高達(dá)90%以上〔6〕，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性〔7～9〕。與 Jin 等〔4〕研究結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MPPP可通過增強(qiáng)成骨細(xì)胞內(nèi)的T-AOC抑制來自H2O2和NaF的氧化損傷，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖。這主要與花色苷類物質(zhì)直接和(或)間接抗氧化機(jī)制有關(guān):一是從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分析，花色苷存在酚羥基，可直接供氫抗氧化;二是通過核因子相關(guān)因子2的參與直接作用于DNA反應(yīng)元件，誘導(dǎo)相關(guān)的抗氧化酶高表達(dá)〔16〕。此外，隨著年齡的增大，機(jī)體代謝能力減弱，組織細(xì)胞自由基不斷積累〔17〕，這就加重了氟骨癥的發(fā)生發(fā)展。因此推測(cè)，針對(duì)年長(zhǎng)者，適量攝入抗氧化食品，在延緩衰老和緩解氟中毒癥狀方面將發(fā)揮積極作用。

總之，MPPP可通過提升成骨細(xì)胞T-AOC抑制NaF誘導(dǎo)的氧化損傷，提示富含花色苷的MPPP在氟骨癥的防治領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值。