重組人血管內皮抑制素對大鼠脈絡膜新生血管的影響

李 偉 蘇銳鋒 付笑笑 楊 潔 張 壘 譚小波 蘇 暢(承德醫學院附屬醫院眼科，河北 承德 067000)

脈絡膜新生血管的病理特征為脈絡膜的新生血管長入色素上皮下間隙或視網膜下引起滲出和出血，進一步發展形成瘢痕影響視力，甚至致盲〔1〕。脈絡膜新生血管多見于黃斑部，影響視力，是致盲的主要原因之一。脈絡膜新生血管在成年人中常見，特別在60歲以上老年人群中更為常見〔2〕。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是脈絡膜新生血管形成的關鍵調節因子，抗VEGF 藥物治療在新生血管的治療中最有潛力〔3，4〕。Endostar是新研發的重組人血管內皮抑制素注射液，具有抑制新生血管生長的作用〔5，6〕。本文探討 Endostar對大鼠脈絡膜新生血管的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 24只健康、體重(220±20)g、挪威雄性大鼠，實驗前雙眼均正常。Endostar(美國Gibco公司)，兔抗大鼠CD31單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美國Sigma公司)，Trizol總RNA提取試劑(美國Abcam公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將24只大鼠隨機分為對照組、模型組(脈絡膜新生血管組)和Endostar組(脈絡膜新生血管+Endostar)，每組8只。

1.2.2 脈絡膜新生血管模型建立 將模型組和Endostar組大鼠10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉成功后，復方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，角膜麻醉采用愛爾凱因滴眼液，放置蓋玻片(滴加少量氧氟沙星眼用凝膠)接觸角膜，以視盤為中心，距離視盤2～3個視盤直徑處，采用氪激光均勻光凝9個點，如果有氣泡產生則表明Bruch膜被擊穿，證明光凝成功。

1.2.3 各組大鼠處理 脈絡膜新生血管形成后1 d，Endostar組大鼠玻璃體注射 5 mg/ml的 Endostar 10 μl，模型組和對照組大鼠玻璃體注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.4 眼底熒光造影檢查 脈絡膜新生血管建模后14 d進行眼底熒光造影檢查。將大鼠麻醉后腹腔注射10%熒光素鈉(0.5 mg/kg)，熒光造影拍照觀察染料滲漏情況，評價脈絡膜新生血管形成情況。脈絡膜新生血管造模成功的標志為造影晚期視盤周圍出現熒光素滲漏。16只大鼠均建模成功。滲漏率=滲漏點數/光凝點數。

1.2.5 脈絡膜新生血管面積測定 眼底熒光造影檢查結束后，麻藥過量處死三組大鼠，打開腹腔、夾閉腹主動脈并剪開右心耳，左心室先灌注PBS 50 ml，再灌注異硫氰酸熒光素-右旋糖苷，摘除眼球，多聚甲醛固定，分離視網膜色素上皮層-脈絡膜-鞏膜并平鋪于玻璃片上，顯微鏡觀察脈絡膜新生血管形態，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量脈絡膜新生血管面積。

1.2.6 脈絡膜新生血管中央厚度測量 將大鼠眼杯在多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切成5 μm厚度切片，脫臘水化后進行免疫熒光染色，以CD31為一抗，陰性對照組以PBS代替一抗，熒光顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量脈絡膜新生血管最大中央厚度。

1.2.7 VEGF、CXC趨化因子配體(CXCL)1和缺氧誘導因子(HIF)-1α mRNA測定 提取大鼠視網膜-脈絡膜-鞏膜復合體DNA，采用PCR測定VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA水平，PCR反應條件:96℃ 4 min，然后94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共 42 個循環，以 GAPDH作為內參照，計算VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA的相對表達量。

1.2.8 VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白測定 提取大鼠視網膜-脈絡膜-鞏膜復合體總蛋白，采用免疫印跡法測定VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平，其相對表達量以圖片的灰度值表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0軟件，兩組計量資料采用t檢驗，多組計量資料采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 Endostar組和模型組脈絡膜新生血管面積、滲漏率比較 Endostar組脈絡膜新生血管面積、厚度、滲透率均明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1。

2.2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較 模型組VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA均顯著高于對照組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA顯著低于模型組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α mRNA和對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 2。

表1 Endostar組和模型組脈絡膜新生血管面積、厚度、滲透率比較(，n=8)

表1 Endostar組和模型組脈絡膜新生血管面積、厚度、滲透率比較(，n=8)

組別 脈絡膜新生血管面積(pixel)脈絡膜新生血管厚度(μm)脈絡膜新生血管滲透率(%)Endostar組 50 324.12±2 647.57 73.24±18.69 48.79±13.24模型組 68 423.32±5 324.13 97.68±21.54 76.42±12.17 t值 10.435 3.657 3.283 P值 0.000 0.000 0.004

表2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較(，n=8)

表2 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α mRNA比較(，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05，與Endostar組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 VEGF mRNA CXCL1 mRNA HIF-1α mRNA對照組 0.10±0.01 1.25±0.26 0.13±0.04 Endostar組 0.12±0.03 1.42±0.31 0.16±0.04模型組 0.25±0.041)2) 2.78±0.451)2) 0.68±0.111)2)F值 83.217 50.326 352.574 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α蛋白水平比較模型組VEGF、CXCL1、HIF-1α水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α 水平顯著低于模型組(P＜0.05)，Endostar組 VEGF、CXCL1、HIF-1α水平和對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比較(，n=8)

表3 三組VEGF、CXCL1和HIF-1α 水平比較(，n=8)

組別 VEGF CXCL1 HIF-1α對照組 0.63±0.12 1.21±0.23 0.58±0.09 Endostar組 0.71±0.14 1.28±0.26 0.66±0.11模型組 1.25±0.171)2) 3.02±0.371)2) 3.12±0.231)2)F值 53.246 69.426 287.363 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

新生血管性疾病的發病基礎為微環境中抑制血管生成因子和促進血管生成因子比例失調。VEGF是最重要的新生血管調控因子，不僅可調控血管內皮細胞的增殖和遷移，對新生血管網絡中的其他分子也具有調控作用。血小板源性生長因子、血管生成素2、堿性成纖維細胞生長因子等促進血管形成細胞因子在新生血管網絡中也發揮重要作用〔7，8〕。內皮細胞抑制素對新生血管生長具有抑制作用，對VEGF等生長因子與其相應受體結合具有阻止作用;對金屬蛋白酶活性具有抑制作用，對其降解細胞外基質具有阻斷作用，可誘導內皮細胞停滯在G1期及凋亡等，較VEGF抗體具有更廣泛的效應〔9，10〕。Endostar作為新型的重組人血管內皮細胞抑制素，耐熱性和耐酸性能較高，半衰期較長，生物活性增加，溶解度升高〔11～13〕。本文結果發現，Endostar具有抑制脈絡膜新生血管形成的作用。

血管生成過程包括內皮細胞和外膜細胞被激活、內皮細胞遷移、膜基質降解、內皮細胞分化、內皮細胞增生、血管成熟與穩定。VEGF通過和內皮細胞膜上的受體結合產生生物學效應，是血管生成最直接的刺激物，對血管生成的大多數環節具有調節作用，包括調節內皮細胞的增生、遷移，血管管腔的形成，內皮細胞外基質的溶解等〔14，15〕。CXCL1可由中性粒細胞、內皮細胞、巨噬細胞分泌，屬于CXC家族成員之一，與其受體結合后參與血管生成反應〔16〕。HIF-1α是缺氧誘導因子，對VEGF和其他相關分子具有調節作用，從而參與血管新生過程〔17，18〕。本研究結果發現，Endostar對脈絡膜新生血管的抑制作用可能與Endostar降低VEGF、CXCL1、HIF-1α 表達有關。VEGF是新生血管的直接刺激物，其水平下降，使其對血管生成的刺激降低，內皮細胞的增生、遷移及血管管腔的形成下降;CXCL1、HIF-1α水平下降使其對血管形成的調節作用下降，從而對脈絡膜新生血管具有抑制作用。