內皮祖細胞對老年大鼠創傷性顱腦損傷的影響

唐 鈺 (吉林醫藥學院附屬醫院放射科，吉林 吉林 132013)

創傷性腦損傷后血管生成是一種反應性保護機制。創傷性腦損傷后腦組織出現缺血缺氧，新生血管的生成具有重要作用，可以改善腦灌注，減輕繼發性神經細胞損傷〔1，2〕。內皮祖細胞可以分化為內皮細胞，是血管內皮細胞的前體，在血管形成中發揮重要作用，內皮祖細胞通過分泌細胞因子促進損傷區新生血管生成〔3，4〕。順磁性氧化鐵(SPIO)可以標記脾臟來源的內皮祖細胞〔5，6〕。本文采用SPIO標記內皮祖細胞，通過CT灌注成像觀察其對老年大鼠創傷性顱腦損傷影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:健康、清潔級、雄性、17～19周齡、Wistar老年大鼠，購自北京生命科學研究所，許可證號:SYXK(京)2015-0003。

主要試劑:胎牛血清、淋巴細胞分離液、SPIO、Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS，美國Sigma公司)，胰蛋白酶、DMEM培養基、山羊抗大鼠CD31多克隆抗體(美國Gibco公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 內皮祖細胞分離、培養和鑒定 將大鼠處死后打開腹腔，分離脾臟組織，沖洗干凈后剪碎，研磨，并加入DPBS沖洗至研磨脾臟變為接近白色，將得到的細胞懸液加入含有淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min，提取單個核細胞的白膜層，再加入DPBS離心，棄去上清液，重復操作2次，支撐細胞懸液，將細胞懸液以3×106/ml接種到培養瓶中培養，觀察細胞貼壁生長情況，采用流式細胞儀對內皮祖細胞進行鑒定。

1.2.2 SPIO標記內皮祖細胞 將SPIO工作液和多聚賴氨酸(PLL)工作液混合制成SPIO-PLL復合標記物，吸棄內皮祖細胞培養瓶中的培養基，加入復合標記物過夜孵育，普魯士藍染色觀察標記的內皮祖細胞:將過夜孵育的內皮祖細胞洗滌后，多聚甲醛固定，加入普魯士藍溶液作用15 min，倒置顯微鏡觀察SPIO標記的內皮祖細胞。

1.2.3 分組 將實驗大鼠隨機分為對照組(24只)、SPIO組(12只)、顱腦損傷組(24只)、內皮祖細胞組(36只)，對照組大鼠不予任何處理，SPIO組大鼠顱腦損傷模型建立后6 h經尾靜脈注射SPIO工作液100 μl，顱腦損傷組大鼠建立顱腦損傷模型，內皮祖細胞組大鼠建立顱腦損傷模型+建模后6 h經尾靜脈注射SPIO標記的內皮祖細胞100 μl(1×106個內皮祖細胞)。

1.2.4 建立創傷性顱腦損傷模型 SPIO組、顱腦損傷組、內皮祖細胞組大鼠建立創傷性顱腦損傷模型。將大鼠腹腔麻醉成功后固定到手術臺上，顱頂部皮膚消毒后行正中縱行切口暴露右側頂骨，眼科鑷擴大骨窗到3 mm×3 mm，將打擊錘自由落體撞擊硬腦膜，止血后縫合頭皮。

1.2.5 各組大鼠建模后CT灌注成像 將對照組、顱腦損傷組和內皮祖細胞組大鼠各12只，移植后3、5、7 d進行CT灌注掃描，利用軟件產生顱腦損傷傷側和健側腦血容量(CBV)、腦血流量(CBF)、平均通過時間(MTT)和表面通透性(PS)，計算灌注指標的相對值(傷側/健側)。

1.2.6 普魯士藍染色 移植后2、24、48 h取SPIO組大鼠和內皮祖細胞組大鼠各4只，處死大鼠后取大鼠腦組織石蠟包埋進行普魯士藍染色。伊紅染液復染，二甲苯固定切片，觀察普魯士藍染色情況。

1.2.7 腦組織CD31+細胞免疫組化染色及微血管計數比較 移植后3、5、7 d取顱腦損傷組，內皮祖細胞組大鼠各8只，處死大鼠，取腦組織進行石蠟包埋，采用SP法對CD31+細胞進行常規免疫組化染色，胞核呈藍色、胞質呈棕色的長條索樣細胞為CD31+細胞，在400倍高倍鏡下選5個高倍視野計數CD31+細胞，取平均值。微血管計數:胞質呈棕染的管腔樣結構的內皮細胞或者兩個及以上細胞之間的連接為微血管，在200倍視野下計數創傷區微血管數量。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0軟件，計量資料兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 SPIO標記的內皮祖細胞對顱腦損傷區域的分布普魯士藍染色結果發現:移植后2、24、48 h，內皮祖細胞組在顱腦損傷區域均見大量藍染顆粒聚集(SPIO標記的內皮祖細胞)。移植后2 h，藍染細胞主要在顱腦損傷組織周邊分布，和非損傷區域界限明顯;移植后24 h，在顱腦損傷區域見少量散在藍染細胞;移植后48 h，在顱腦損傷區域中央見大量藍染細胞，表明SPIO標記的內皮祖細胞隨著時間的延長，從顱腦損傷區域周邊向顱腦損傷區域中央聚集;SPIO組在移植后2、24、48 h在顱腦損傷區域均未見藍染細胞，表明SPIO沒有向顱腦損傷區域聚集的能力。

2.2 顱腦損傷組和內皮祖細胞組微血管計數比較內皮祖細胞組移植后3、5、7 d顱腦損傷區微血管計數均顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)。見表1。

2.3 顱腦損傷組和內皮祖細胞組CD31+細胞數比較內皮祖細胞組移植后3、5、7 d顱腦損傷區CD31+細胞數均顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)。見表2。

表1 顱腦損傷組和內皮祖細胞組微血管計數比較(，n=8)

表1 顱腦損傷組和內皮祖細胞組微血管計數比較(，n=8)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d顱腦損傷組 35.46±4.23 47.68±5.21 55.46±5.31內皮祖細胞組 55.47±4.68 76.56±5.34 83.24±5.47 t值 10.783 11.423 8.857 P值 0.000 0.000 0.000

表2 顱腦損傷組和內皮祖細胞組CD31+細胞數比較(，n=8)

表2 顱腦損傷組和內皮祖細胞組CD31+細胞數比較(，n=8)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d顱腦損傷組 77.65±6.87 114.35±9.12 129.78±8.32內皮祖細胞組 121.43±8.21 163.24±9.53 178.69±8.57 t值 14.236 13.264 11.423 P值 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠CT灌注參數比較 顱腦損傷組大鼠移植后3、5、7 d相對腦血容量(rCBV)、相對腦血流量(rCBF)、PS值均顯著高于對照組(P＜0.05)，移植后相對平均通過時間(rMTT)值和對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);內皮祖細胞組移植后3 d和移植后5 d rCBV值顯著低于顱腦損傷組(P＜0.05)，移植后7 d rCBV值和顱腦損傷組比較差異無統計學意義(P＞0.05);內皮祖細胞組移植后 3、5、7 d rCBF和 PS值均顯著低于顱腦損傷組(P＜0.05)，移植后5 d rMTT值顯著高于顱腦損傷組(P＜0.05)，內皮祖細胞組移植后3、7 d rMTT值和顱腦損傷組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3～表6。

表3 各組大鼠rCBV比較(，n=12，%)

表3 各組大鼠rCBV比較(，n=12，%)

與對照組比較:1)P＜0.05;與顱腦損傷組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對照組 101.23±5.46 102.13±5.37 101.75±5.18顱腦損傷組 179.89±32.141) 139.35±27.581) 124.34±21.261)內皮祖細胞組164.23±28.671)2) 82.31±19.831)2) 123.43±16.531)F值 43.264 31.243 13.231 P值 0.000 0.000 0.000

表4 各組大鼠rCBF比較(，n=12，%)

表4 各組大鼠rCBF比較(，n=12，%)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對照組 98.78±0.76 99.32±0.83 98.97±0.85顱腦損傷組 173.24±31.521) 139.84±28.671) 124.38±18.791)內皮祖細胞組148.75±26.461)2) 81.32±17.681)2) 109.48±16.531)2)F值 39.856 33.152 14.264 P值 0.000 0.000 0.000

表5 各組大鼠rMTT比較(，n=12，%)

表5 各組大鼠rMTT比較(，n=12，%)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對照組 101.32±4.65 102.64±5.36 101.87±4.86顱腦損傷組 102.53±8.67 101.73±7.54 99.96±7.83內皮祖細胞組 108.42±8.47 119.78±10.532) 102.31±8.02 F值 0.146 12.435 0.115 P值 0.836 0.000 0.867

表6 各組大鼠PS比較(，n=12，ml·100 g－1·min－1)

表6 各組大鼠PS比較(，n=12，ml·100 g－1·min－1)

組別 移植后3 d 移植后5 d 移植后7 d對照組 0.02±0.01 0.01±0.01 0.03±0.02顱腦損傷組 10.43±0.781) 7.68±0.571) 3.78±0.631)內皮祖細胞組 7.68±0.931)2) 4.47±0.531)2) 0.02±0.012)F值 344.264 253.254 66.364 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

血管再生指血管以分裂或出芽的方式形成新的血管網，為細胞組織提供營養物質和氧氣，改善局部組織血供，顱腦損傷后的血管再生可以恢復損傷區血供，減輕神經元受到的損害，顱腦損傷后血管再生在繼發性損傷和創傷修復過程中發揮重要作用，因此促進顱腦損傷患者血管再生對損傷后修復具有重要作用〔7～9〕。內皮祖細胞參與新生血管的形成，顱腦損傷后局部缺血缺氧引起堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子等多種細胞因子表達上調，上述細胞因子的升高動員骨髓中內皮祖細胞，使內皮祖細胞和基質細胞的黏附作用降低進入血液，血液循環中的內皮祖細胞在黏附分子的作用下聚集到損傷部位，在損傷部位通過整合機制整合到新生血管壁內增殖分化為血管內皮細胞參與新生血管的生成;內皮祖細胞在局部微環境的作用下可以分化為血管內皮細胞參與血管內膜的再生;內皮祖細胞還可以通過旁分泌的方式影響血管生成因子的釋放，促進血管內皮化，增加新生血管數量〔10～12〕。本文研究發現SPIO標記的內皮祖細胞可以增加顱腦損傷大鼠顱腦損傷區微血管計數和CD31+細胞數量，內皮祖細胞能夠促進顱腦損傷大鼠顱腦損傷局部新生血管生成，能夠促進顱腦損傷的修復。

CT灌注成像是腦功能成像的方法之一，可以通過組織血管化程度及血流灌注狀態獲得微循環的信號，可以通過CBV、CBF、MTT、PS等灌注參數反映內部微血管密度和血流動力學特點等情況，可以間接反映內皮祖細胞參與顱腦損傷區域血管再生的過程〔13，14〕。血液黏滯度、微動脈直徑、動脈壓、顱內壓等決定了損傷灶局部的血流量，微動脈和微靜脈直徑的大小決定了CBV值，在機體創傷情況下血管自身調節功能異常，引起CBV值下降，從而導致組織灌注不足引起繼發損傷，損傷早期腦水腫為血管性水腫，呈低灌注狀態，對機體損害不大，隨著病情進展發展為細胞毒性腦水腫，細胞毒性腦水腫對輕微損傷的神經元造成無法逆轉的損傷，呈高灌注狀態〔15〕。本研究結果發現，創傷性顱腦損傷大鼠腦損傷區處于高灌注期，內皮祖細胞抑制可以改善腦損傷區的高灌注水平，表面通透性恢復也比較快。