芒柄花黃素對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力及海馬毛細血管超微結構的影響

費洪新 李 林 趙 坤 柏青楊 韓麗君 沈 博 明 玥 張英博 興桂華 李春旭(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

阿爾茨海默病(AD)是常見的老年性疾病之一，其病理特征為神經元外沉積 β-淀粉樣蛋白(Aβ)〔1〕，Aβ積累后誘導腦組織小膠質細胞(MG)活化，促進炎癥介質上調〔2〕，一旦Aβ產生和清除平衡破壞會引起血管毒性〔3〕，Aβ 清除異常可導致學習記憶障礙〔4〕，伴有海馬血管內皮細胞超微結構變化〔5〕。已經證實Aβ由低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)1與晚期糖基化終產物(RAGE)受體介導清除〔6，7〕，RAGE/Aβ 參與調節從機體周邊到腦運輸〔8〕，腦內RAGE可增加核轉錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β 表達〔9，10〕，最終促進 AD 的發生發展。前期研究顯示，補陽還五湯有效成分黃芪多糖可保護AD模型海馬組織〔11〕。現代藥理學研究顯示，補陽還五湯有效成分芒柄花黃素(FMN)可減弱 Aβ誘導HT22 細胞毒性〔12〕、調控新生血管形成〔13，14〕、降低糖尿病小鼠高血糖〔15〕等。目前尚未見文獻報道FMN用于AD小鼠，本實驗分析FMN對AD小鼠學習記憶能力及海馬毛細血管超微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性C57小鼠，鼠齡2周齡，體重(20±2)g，42只，由黑龍江中醫藥大學李寶龍副教授、副主任提供〔動物許可證號:SCXK(黑)2013-012〕。

1.2 儀器和試劑 透射電鏡(荷蘭公司)，Morris水迷宮(MWM)(安徽淮北正華公司)，RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)，腦立體定位儀(成都儀器廠)，FMN(成都曼思特生物公司，16031005)，多奈哌齊(中國重慶植恩藥業公司，20141201)，LRP1(Santa Cruz公司，sc-25469)，RAGE(Boster公司，ba-1789)，酶聯免疫試劑盒IL-1β、TNF-α、IL-6細胞因子(南京建成生物工程研究所)，Aβ1～42(Sigma公司)。

1.3 AD模型的建立 除對照組外，參考文獻〔16，17〕方法造模，麻醉、固定、定位后，小鼠雙側腦室海馬區一次性注入 Aβ1～42(80 pmol/μl，10 μg);對照組雙側腦室內無菌條件下注射10 μl生理鹽水。

1.4 分組與給藥 按照隨機數字表隨機分為FMN高劑量組(30.0mg/kg灌胃)、FMN 中劑量組(15.0 mg/kg灌胃)、FMN低劑量組(7.5 mg/kg灌胃)、多奈哌齊組(1 mg/kg灌胃)、模型組(生理鹽水灌胃)、對照組(生理鹽水灌胃)，每組7只，持續給藥30 d。

1.5 檢測學習能力 各組實驗小鼠經過灌胃結束后，采用MWM系統測定小鼠學習能力，該儀器水深20 cm，水溫(23±2)℃，平臺放于第Ⅳ象限，訓練時間為第1～4天，60 s/次，若60 s未找到平臺，將小鼠放平臺15 s潛伏期計為60 s，第5天測定小鼠學習能力。

1.6 測定記憶能力 過程同1.5，第5天撤去MWM平臺，經過MWM記錄軌跡并分析60 s小鼠找到平臺的游泳距離。

1.7 測定學習記憶保持能力 過程同1.5，第5天撤去MWM平臺，經過MWM記錄軌跡并觀察60 s內小鼠的目標停留時間和跨平臺次數。

1.8 觀察海馬CA3區毛細血管結構 實驗結束后，經心臟灌注器灌注后，取材海馬，經過常規固定、脫水、包埋、切片等進行觀察。

1.9 檢測海馬LRP1、RAGE表達 按照免疫組織化學法(IHC)常規制備石蠟切片，經過脫蠟、滅活、封閉、加抗、顯色、復染、脫水、透明、封片等，計數海馬平均光密度值(MOD)。

1.10 檢測海馬 IL-1β、IL-6、TNF-α含量 實驗結束后斷頭處死小鼠，取材海馬，經勻漿、靜置、離心、分裝等，于450 nm波長檢測吸光度(A)，按照常規酶聯免疫吸附分析方法求得炎癥介質含量。

1.11 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行正態性和方差齊性檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 學習能力 小鼠潛伏期在1～5 d呈逐漸下降趨勢，與對照組第5天比較，模型組潛伏期明顯延長(P＜0.05);與模型組第5天比較，多奈哌齊組、FMN高劑量組、FMN高劑量組、FMN高、中劑量組潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。見表1。

2.2 記憶能力 小鼠游泳距離在1～5 d呈逐漸下降趨勢，與對照組第5天比較，模型組游泳距離明顯增加(P＜0.05);與模型組第5天比較，多奈哌齊組、FMN高、中劑量組游泳距離明顯減少(P＜0.05)。見表2。

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d對照組 57．023 8±1．099 8 49．509 5±2．361 2 40．952 4±1．577 7 30．876 2±2．514 3 22．804 8±2．799 4模型組 57．128 6±0．975 7 50．100 0±2．884 6 48．428 6±3．155 4 41．409 5±3．393 7 41．161 9±4．215 71)多奈哌齊組 56．114 3±1．390 0 51．809 5±1．905 4 41．361 9±2．925 4 32．357 1±1．874 5 23．766 7±2．384 22)FMN 高劑量組 56．766 7±1．010 5 52．595 2±2．741 9 41．285 7±2．484 6 31．766 7±2．690 7 24．438 1±4．498 32)FMN 中劑量組 56．376 2±1．072 2 51．838 1±1．877 4 40．957 1±2．152 1 31．409 5±1．604 4 25．057 1±2．772 92)FMN 低劑量組 56．842 9±1．150 0 52．757 1±1．740 5 48．509 5±4．129 8 36．547 6±4．476 4 38．109 5±3．705 5

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，下表同

表2 各組撤去平臺后不同時間點記憶能力比較(，n=7，游泳距離，cm)

表2 各組撤去平臺后不同時間點記憶能力比較(，n=7，游泳距離，cm)

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d對照組 1 189．624 8±51．512 2 1 036．207 6±54．081 9 891．913 8±99．298 0 652．790 5±65．455 9 540．406 2±81．882 8模型組 1 180．069 5±22．295 0 1 134．007 1±66．018 4 1 101．402 4±84．455 9 930．635 2±45．655 8 767．374 8±79．894 91)多奈哌齊組 1 194．508 1±41．851 7 1 022．766 7±99．109 0 936．255 2±70．103 8 703．162 4±91．476 6 628．737 6±63．802 62)FMN 高劑量組 1 191．115 7±25．088 7 1 022．209 5±86．861 9 969．654 8±80．872 0 756．026 2±119．378 7 604．744 3±41．916 62)FMN 中劑量組 1 167．068 1±40．282 4 1 032．011 4±90．389 3 982．152 4±66．051 5 731．331 9±91．828 1 601．234 3±57．815 32)FMN 低劑量組 5 1 181．251 9±30．062 5 1 006．328 1±38．473 5 1 087．658 1±107．205 0 898．355 7±62．993 6 728．937 6±89．002 9

2.3 學習記憶保持能力 與對照組比較，模型組目標停留時間明顯縮短且跨平臺次數明顯減少(P＜0.05);與模型組比較，多奈哌齊組，FMN高、中劑量組目標停留時間明顯延長且跨平臺次數明顯增加(P＜0.05)。見表3。

2.4 海馬CA3區毛細血管超微結構 對照組海馬毛細血管管壁較厚，細胞核清晰，細胞質豐富;模型組海馬CA3區毛細血管管壁薄，核固縮，細胞質不豐富;多奈哌齊組，FMN高、中劑量組細胞核正常，細胞質豐富;FMN低劑量組海馬CA3區毛細血管結構欠佳。見圖1。

表3 各組目標停留時間和跨平臺次數比較(，n=7)

表3 各組目標停留時間和跨平臺次數比較(，n=7)

組別 目標停留時間(s) 跨平臺次數(次)對照組 21．428 6±3．283 7 5．285 7±1．799 5模型組 11．905 7±2．371 81) 2．571 4±0．975 91)多奈哌齊組 19．391 4±2．754 72) 4．571 4±1．511 92)FMN 高劑量組 19．874 3±2．433 12) 4．142 9±1．345 22)FMN 中劑量組 18．078 6±1．829 22) 4．285 7±1．112 72)FMN 低劑量組 12．915 7±2．154 4 3．142 9±0．690 1

2.5 海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 與對照組比較，模型組海馬LRP1表達量明顯降低(P＜0.05)，RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯升高 (P ＜0.05);與模型組比較，多奈哌齊組，FMN高、中劑量組小鼠海馬 LRP1明顯升高(P＜0.05)，RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯降低(P＜0.05)。見表 4。

圖1 各組海馬CA3區毛細血管超微結構(透射電鏡)

表 4 各組海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平(，n=7)

表 4 各組海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平(，n=7)

組別 LRP1 RAGE IL-1β(pg/ml) IL-6(ng/ml) TNF-α(pg/ml)對照組 0．366 4±0．070 6 0．262 9±0．045 6 156．583 3±41．602 6 6．258 9±0．896 7 826．564 6±93．191 4模型組 0．233 9±0．032 01) 0．377 5±0．055 61) 245．898 8±33．184 31) 9．144 8±1．165 81) 1 248．809 5±200．523 91)多奈哌齊組 0．329 1±0．053 42) 0．273 6±0．028 02) 166．166 7±34．548 42) 6．513 5±0．955 62) 883．911 6±123．621 02)FMN 高劑量組 0．333 9±0．037 72) 0．286 9±0．035 02) 173．190 5±44．257 32) 7．066 8±0．999 32) 910．782 3±129．303 52)FMN 中劑量組 0．328 4±0．043 02) 0．276 2±0．039 12) 161．761 9±51．026 82) 7．659 9±1．015 22) 927．517 0±105．098 22)FMN 低劑量組 0．242 9±0．038 0 0．344 1±0．032 2 217．476 2±45．407 4 8．888 4±0．933 4 1 108．537 4±107．057 1

3 討論

本文結果表明AD小鼠學習記憶能力減退，FMN高、中劑量有效改善AD小鼠學習能力、記憶能力。FMN高、中劑量可改善AD小鼠海馬學習記憶的關鍵區域——CA3區毛細血管超微結構，以此減弱小鼠海馬的損傷。FMN高、中劑量可改善小鼠學習記憶和毛細血管超微結構，這與小鼠海馬LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平改善有關。綜上，FMN通過改善AD小鼠海馬Aβ轉運蛋白和炎癥介質水平來改善學習記憶能力和海馬毛細血管超微結構。