乳鼠雪旺細(xì)胞與自體顱骨組織塊體外聯(lián)合培養(yǎng)對顱骨組織生長的影響

李鐘鵬 龐芳河 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院綜合門診，廣西 南寧 530021)

骨組織工程學(xué)發(fā)展迅速，在諸多領(lǐng)域取得良好成果，隨著支架材料研究的深入，大量復(fù)合支架材料在骨缺損修復(fù)中被廣泛研究〔1〕，但因神經(jīng)化、血管化因素的影響使復(fù)合支架材料在臨床上沒有被廣泛應(yīng)用。組織工程化骨組織在體內(nèi)存活的關(guān)鍵因素為完善的神經(jīng)支配和充足的血液供應(yīng)，近年來組織工程化骨的血液供應(yīng)方面的研究取得比較大的進(jìn)步〔2，3〕，但神經(jīng)支配仍然是組織工程化骨面臨的難題。雪旺細(xì)胞為周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為常用的周圍神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞〔4，5〕。本文將雪旺細(xì)胞與自體顱骨組織聯(lián)合培養(yǎng)觀察其對顱骨生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)乳鼠:出生1～5 d、清潔級(jí)、雄性、Sprague Dawley乳鼠(購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK桂2014-0001)。實(shí)驗(yàn)試劑:BFGF和鈦板(武漢德骼拜爾外科植入物有限公司)，S-100抗體、SABC試劑盒等(武漢博士德生物工程公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等(美國Gibco公司)。

1.2 雪旺細(xì)胞培養(yǎng)和純化及鑒定 取乳鼠9只頸椎脫臼處死，浸泡乙醇中消毒，將消毒后乳鼠治愈解剖板上分離坐骨神經(jīng)，將其剪成約1 mm3組織碎塊，加入胰蛋白酶和膠原酶，移入離心管中，在水浴振蕩箱中消化 35 min，加入 DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清液，重懸離心后細(xì)胞。取細(xì)胞懸液加入RP管中，加入臺(tái)盼藍(lán)混勻，取混合液滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)未被染液著色的細(xì)胞數(shù)目，將細(xì)胞(密度為1×105個(gè)/ml)接種到培養(yǎng)皿，12 h換液并加入阿糖胞苷，48 h換液，觀察細(xì)胞生長情況。將上述細(xì)胞培養(yǎng)12 d，胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后接種到6孔板中培養(yǎng)3 d，采用S-100抗體鑒定:磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定，PBS清洗，加入過氧化氫(H2O2)阻斷血源性過氧化物酶，PBS清洗，加入胎牛血清(BSA)封閉血清，PBS清洗，加入兔S-100單克隆抗體孵育，PBS清洗，加入生物素化羊抗小鼠孵育，PBS清洗，加入SABC孵育，PBS清洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察出現(xiàn)陽性染色、背景不著色為準(zhǔn)，晾干玻片，中性樹膠封片。

1.3 顱骨組織塊取材、分組及處理 取9只乳鼠斷頸處死，乙醇中消毒，PBS沖洗，無菌條件下取出顱骨，剔除骨外膜、內(nèi)膜等纖維結(jié)締組織，PBS沖洗露骨組織，剪成2 mm×2 mm大小顱骨塊，每只乳鼠取3塊，共27塊顱骨塊。將27塊顱骨組織塊分為A組、B組和C組，每組9塊，分別培養(yǎng)1 w、2 w、3 w。A組顱骨組織塊單獨(dú)培養(yǎng)，不加雪旺細(xì)胞干預(yù);B組為雪旺細(xì)胞和顱骨組織快直接接觸培養(yǎng)，將濃度為1×106個(gè)/ml的雪旺細(xì)胞懸液加入DMEM培養(yǎng)皿中，將顱骨組織塊加入培養(yǎng)皿中和雪旺細(xì)胞直接接觸培養(yǎng);C組為雪旺細(xì)胞和顱骨組織塊通過鈦板間接接觸培養(yǎng)，將濃度為1×106個(gè)/ml的雪旺細(xì)胞懸液加入DMEM培養(yǎng)皿中貼壁生長，放入鈦板，將顱骨組織快放入鈦板上的空隙內(nèi)，使雪旺細(xì)胞和顱骨組織塊間接接觸培養(yǎng)。

1.4 顱骨組織BGP和OPN水平測定 三組分別在培養(yǎng)1 w、2 w、3 w時(shí)取材，每周取3塊顱骨組織塊，甲醛固定、石蠟包埋，采用常規(guī)HE染色，采用免疫組化法測定顱骨組織BGP和OPN水平，采用Image-ProP-lus6.0圖像處理系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析，測定骨組織中陽性細(xì)胞及基質(zhì)中染色光密度值。每周3個(gè)顱骨組織塊，每塊取4個(gè)切片，每組切片取3個(gè)視野，共36個(gè)視野，陽性表達(dá)的灰度值為該顱骨塊的平均光密度值。

1.5 培養(yǎng)液中BALP活性含量測定 收集培養(yǎng)1 w、2 w、3 w時(shí)三組培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定培養(yǎng)液中BALP活性含量，具體步驟按照說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析及S-N-K檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雪旺細(xì)胞培養(yǎng)和純化及鑒定 接種24 h后大部分雪旺細(xì)胞已貼壁生長;接種48 h后細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞兩端突起不等;接種7 d大部分雪旺細(xì)胞胞體平行排列，細(xì)胞呈極性生長;接種12 d雪旺細(xì)胞交織成網(wǎng)狀，大部分連接在一起呈“地毯”狀。見圖1。對接種14 d雪旺細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞邊界清楚，胞體呈梭形，胞質(zhì)黃染;雪旺細(xì)胞純度在89%左右。見圖2。

2.2 三組顱骨組織中BGP水平比較 三組之間BGP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.912，P＜0.001)。兩兩比較:B組各時(shí)間點(diǎn)BGP水平明顯高于A組和C組(P＜0.05)，C組各時(shí)間點(diǎn)BGP水平明顯高于A組(P＜0.05);同組不同時(shí)間點(diǎn)BGP水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著時(shí)間延長BGP水平升高。見表1和圖3。

圖1 雪旺細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果(HE，×400)

圖2 雪旺細(xì)胞免疫組化染色(DAB，×400)

表1 三組顱骨組織培養(yǎng)不同時(shí)間BGP水平比較(，n=36，%)

表1 三組顱骨組織培養(yǎng)不同時(shí)間BGP水平比較(，n=36，%)

與B組比較:1)P＜0.05;與A組比較:2)P＜0.05;與同組前一時(shí)點(diǎn)比較:3)P＜0.05，下表同

組別 第1周 第2周 第3周A 組 7.487±2.4961) 8.358±1.8121)3) 11.953±1.1321)3)B 組 11.895±3.602 13.703±3.4853) 18.381±5.214 C 組 9.485±3.5481)2) 10.760±2.1531)2)3) 15.925±3.2141)2)3)

圖3 各組培養(yǎng)不同時(shí)間BGP免疫組化染色(DAB，×400)

2.3 三組顱骨組織中OPN水平比較 三組之間BGP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.510，P＞0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)和不同組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2和圖4。

2.4 三組顱骨組織BALP活性比較 三組之間BALP活性含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.726，P＜0.05)。兩兩比較:B組各時(shí)間點(diǎn)BALP活性含量明顯高于A組和C組(P＜0.05)，C組各時(shí)間點(diǎn)BALP活性含量明顯高于A組(P＜0.05);同組不同時(shí)間點(diǎn)BALP活性含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著時(shí)間延長BALP活性含量升高。見表3。

表2 三組培養(yǎng)不同時(shí)間顱骨組織中OPN水平比較(，n=36，%)

表2 三組培養(yǎng)不同時(shí)間顱骨組織中OPN水平比較(，n=36，%)

組別 第1周 第2周 第3周A 組 9.669±1.304 10.124±2.138 9.203±1.063 B 組 10.786±2.115 10.197±1.212 11.034±2.142 C 組 9.272±1.008 10.710±1.058 9.135±2.285

圖4 各組培養(yǎng)不同時(shí)間OPN免疫組化染色(DAB，×400)

表3 三組培養(yǎng)不同時(shí)間顱骨組織中BALP活性比較(，n=9，金氏單位/L)

表3 三組培養(yǎng)不同時(shí)間顱骨組織中BALP活性比較(，n=9，金氏單位/L)

組別 第1周 第2周 第3周A 組 97.434±12.2041) 102.588±24.5211)3)137.581±18.1591)3)B 組 123.203±19.634 302.789±60.4153) 709.713±48.9853)C 組 100.011±22.0451)2)214.658±21.2081)2)3)370.074±37.7561)2)3)

3 討論

隨著組織工程骨研究的深入，如何使構(gòu)建的組織工程骨在體內(nèi)存活并迅速發(fā)揮作用是目前面臨的主要問題，骨組織為一種復(fù)合體，不是單一的硬性組織，還含有血管、神經(jīng)、筋膜等其他軟組織，帶有血管系統(tǒng)和神經(jīng)支配的復(fù)合組織工程骨的構(gòu)建是比較理想的解決方案，在構(gòu)建組織工程骨的同時(shí)重建神經(jīng)支配和血液供應(yīng)是組織工程骨從基礎(chǔ)研究到臨床的關(guān)鍵問題〔6～8〕。目前血管化組織工程骨的研究取得了較大進(jìn)展〔9～11〕，而神經(jīng)化組織工程骨仍是目前面臨的問題。神經(jīng)和營養(yǎng)血管進(jìn)入骨髓，對骨組織的形成、發(fā)育及代謝發(fā)揮重要作用;周圍神經(jīng)及其分泌的神經(jīng)肽對骨的再生具有重要作用，雪旺細(xì)胞的存在形式有兩種，一種包繞軸突形成髓鞘，一種包繞軸突不形成髓鞘，雪旺細(xì)胞的成熟過程包括:雪旺細(xì)胞前體-不成熟雪旺細(xì)胞-成熟雪旺細(xì)胞，主要來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子及血小板生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子等其他細(xì)胞因子，神經(jīng)營養(yǎng)因子具有神經(jīng)再生提高支架和再生環(huán)境、清除細(xì)胞碎片、組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等作用;神經(jīng)生長因子參與神經(jīng)細(xì)胞的生長、再生和發(fā)育等;血小板生長因子等其他細(xì)胞因子可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成等〔12〕。雪旺細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞再生中具有重要作用，是周圍神經(jīng)組織工程常用的種子細(xì)胞〔13〕。BGP是重要的骨代謝指標(biāo)，BGP水平高低和影響骨改建過程，成骨細(xì)胞功能增強(qiáng)則BGP水平升高，成骨細(xì)胞功能減弱則 BGP水平下降〔14，15〕。本研究表明雪旺細(xì)胞可促進(jìn)成骨細(xì)胞功能，其中兩者直接接觸發(fā)揮主要促進(jìn)作用。OPN有骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分泌，為分泌性磷酸化蛋白，可識(shí)別骨基質(zhì)和破骨細(xì)胞之間黏附，并通過對骨基質(zhì)和破骨細(xì)胞之間黏附的調(diào)節(jié)影響骨吸收〔16，17〕，本研究發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞和顱骨組織共同培養(yǎng)對骨組織OPN水平的影響不明顯，考慮雪旺細(xì)胞對顱骨組織的改建和吸收影響不大。BALP由成骨細(xì)胞生產(chǎn)，在骨形成和骨細(xì)胞活性中發(fā)揮重要作用，骨形成超過骨吸收時(shí)，成骨細(xì)胞分泌大量的BALP，引起B(yǎng)ALP活性增加〔18〕，本研究發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞可增加骨組織BALP活性，促進(jìn)骨組織生長，其中兩者直接接觸發(fā)揮主要促進(jìn)作用。