利拉魯肽調節2型糖尿病大鼠肝臟脂質沉積的機制探討*

郭皓宇，曾亞，申月明，王俊，侯周華

（1.湖南省長沙市中心醫院 消化科，湖南 長沙 410004；2.中南大學湘雅醫院 感染病科，湖南 長沙 410008）

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）是腸道L細胞分泌的激素[1]。人類的GLP-1受體在第6號染色體[2]。GLP-1可通過抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空等作用調控血糖[3]。GLP-1受體激動劑通過SIRT1改善小鼠非酒精性脂肪肝[4]。利拉魯肽是臨床一線藥[5]，其調節脂肪肝作用仍未明確。

在表達GLP-1的ob/ob小鼠中，脂肪酸合酶（fatty acid synthase, FAS）表達降低，說明GLP-1能調節肝臟脂質沉積[6]。其他研究顯示，脂肪肝模型中膽固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c）被激活，提示SREBP-1c是脂肪肝的主要調控因素[7]。

本研究通過利拉魯肽干預2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）大鼠，探討其對T2DM大鼠肝臟脂質沉積的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30只雄性SD大鼠，7～8周齡，體重180～200 g，購自中南大學實驗動物學部。

1.1.2 主要試劑及儀器 高脂飼料（脂肪60%）（美國Research Diets公司），利拉魯肽注射液[北京諾和諾德（中國）制藥有限公司]，血清脂聯素酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（美國RayBiotech公司），腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase, AMPK）抗體、磷酸化的AMP激活的蛋白激酶（Thr172p-AMPK）抗體、β-actin（13E5）抗體購自美國CST公司，膽固醇調節因子結合蛋白1（sterolregulatory element binding proteins 1, SREBP1）抗體（英國Abcam公司），鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）、油紅O染色試劑購自美國Sigma公司，Optium血糖檢測試紙（美國雅培公司），正立顯微成像系統BX51WI（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復制及干預 30只雄性SD大鼠在（22±2）℃、濕度50%、12 h晝/夜循環照明的潔凈環境中，以干燥玉米碎末為墊料，5只/籠，自由取水和飲食適應性喂養2周。根據體重隨機抽取20只SD大鼠復制T2DM模型：高脂飼料（脂肪60%）喂養5周，隨后腹腔注射STZ（35 mg/kg體重），3 d后經尾靜脈取血測量空腹血糖。空腹血糖＞13.8 mmol/L即T2DM大鼠模型復制成功[8-9]。

1.2.2 實驗分組 將T2DM大鼠模型隨機分為兩組，每組10只。糖尿病組大鼠維持高脂喂養，不干預；利拉魯肽組大鼠維持高脂喂養，并通過腹腔注射利拉魯肽（0.225μg/g體重），2次/d[10]。剩余10只大鼠以普通飼料（脂肪10%）常規喂養，作為對照組。以利拉魯肽治療后8周作為實驗終點，處死實驗動物前取全血并分離血清，處死動物后立刻切取肝臟標本，置于液氮罐中快速冷凍，隨后轉移至-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.3 臨床指標 監測血糖時大鼠禁食8 h。采用Optium血糖檢測試紙檢測大鼠空腹血糖。在室溫下將1滴血液標本滴于試紙樣品槽，血糖監測儀自動讀出血糖濃度，每個標本檢測3次[4]。收集動物標本后，用離心法從全血中分離出血清，用酶法檢測血清中三酰甘油和總膽固醇的含量，每個標本重復測量3次。所有檢測方法按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 肝組織冷凍切片油紅O染色 將獲取的新鮮肝組織浸泡于液氮中快速冷卻，隨后轉移至冷凍切片機中進行冷凍切片，厚度約8μm。將冷凍切片用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min，再以PBS洗滌3次。將已固定的切片浸泡于0.5%油紅O染液10～15 min后，轉移至60%酒精中，分化切片至間質清晰。采用蘇木精染液對細胞核進行復染1～2 min。將切片在流動雙蒸水中沖洗后以中性樹膠封片。將油紅O染色肝臟切片置于光學顯微鏡下，觀察肝組織的脂肪沉積情況[4]。

1.2.5 血清脂聯素水平檢測 采用脂聯素ELISA試劑盒檢測血清脂聯素水平。在預鋪脂聯素一抗的96孔板中加入大鼠的血清樣品和不同濃度的標準品，37℃條件下孵育后洗滌，加入鏈接辣根過氧化物酶標記的抗生物素二抗，孵育后再次洗滌。加入四甲基聯苯胺底物，室溫下顯色1 min后加入硫酸終止顯色反應。立即在酶標儀中測量各孔450 nm波長處的吸光度，通過建立標準曲線計算各血清標本中脂聯素水平。

1.2.6 Western blot檢測 采用Western blot檢測肝組織中Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白的表達水平。在冷浴條件下用勻漿器對肝臟進行勻漿分散。在每個標本的分散液中加入裂解液，提取標本的總蛋白和核蛋白。以BCA法建立蛋白定量標準曲線后，定量計算各肝臟標本中的總蛋白和蛋白濃度。由于Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c及β-actin蛋白分子量差異明顯，室溫下分別用7%和10% SDSPAGE膠對蛋白電泳分離1.0～1.5 h，在冷浴條件下轉膜45 min。用5%脫脂奶粉溶液完全浸泡PVDF膜，室溫下封閉2 h。分別將膜在相應的抗體中進行孵育，4℃條件下孵育過夜。次日將膜洗滌3次后，加入熒光二抗在室溫下避光孵育，洗滌后在多功能成像儀暗室中曝光、成像、記錄圖像。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠臨床指標比較

2.1.1 體重 3組大鼠體重比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組比較，糖尿病組大鼠體重增加（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的體重（P＜0.05）。見表 1。

2.1.2 空腹血糖 3組大鼠空腹血糖比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組比較，糖尿病組大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的空腹血糖（P＜0.05）。見表1。

2.1.3 三酰甘油 3組大鼠血清三酰甘油水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組比較，糖尿病組大鼠三酰甘油水平升高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，利拉魯肽降低了大鼠的三酰甘油水平（P＜0.05）。見表1。

2.1.4 總膽固醇 3組大鼠血清總膽固醇水平比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠臨床指標比較 （n =10，±s）

表1 各組大鼠臨床指標比較 （n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與糖尿病組比較，P ＜0.05

組別 體重/g 空腹血糖/（mmol/L） 三酰甘油/（mmol/L） 總膽固醇/（mmol/L）對照組 375.12±6.312 4.910±0.301 0.594±0.093 7.544±1.982糖尿病組 419.42±8.1111） 18.042±0.4921） 2.022±0.0641） 9.869±2.321利拉魯肽組 336.33±12.1232） 8.030±0.3612） 0.613±0.0712） 7.348±3.033 F值 2.749 5.448 6.749 0.774 P值 0.047 0.002 0.002 0.538

2.2 利拉魯肽減輕T2DM大鼠的脂質沉積

肝臟冷凍切片油紅O染色可見對照組大鼠肝臟中幾乎無脂肪沉積，而糖尿病組T2DM大鼠肝臟中可見大量的脂肪滴沉積。T2DM大鼠經利拉魯肽治療后，肝臟組織也可見脂質沉積，但其沉積程度低于糖尿病組。見圖1。

圖1 各組大鼠脂質沉積情況 （油紅O染色×20）

2.3 利拉魯肽對血清脂聯素的影響

對照組、糖尿病組、利拉魯肽組大鼠血清脂聯素水平分別為（49.84±3.56）、（16.84±1.45）和（86.55±4.44）ng/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=6.128，P=0.004）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組比較，糖尿病組大鼠血清脂聯素水平降低61.51%（t=5.448，P=0.044）；經利拉魯肽治療后大鼠血清脂聯素水平較糖尿病組升高4.61倍（t=6.512，P=0.0043）。

2.4 利拉魯肽對大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達的影響

3組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，糖尿病組大鼠肝臟AMPK和Thr172p-AMPK蛋白表達水平較對照組降低（P＜0.05），而SREBP-1c蛋白表達水平升高（P＜0.05）；利拉魯肽干預治療后，利拉魯肽組大鼠肝臟Thr172p-AMPK和AMPK蛋白相對表達量回升（P＜0.05），同時SREBP-1c蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

表2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與糖尿病組比較，P ＜0.05

組別 Thr172p-AMPK AMPK SREBP-1c對照組 1.15±0.46 3.18±1.11 0.594±0.12糖尿病組 0.99±0.231） 1.75±0.541） 4.11±0.981）利拉魯肽組 3.98±0.992） 2.93±0.882） 0.613±0.112）F值 2.881 4.452 7.113 P值 0.038 0.015 0.015

圖2 各組大鼠肝臟Thr172p-AMPK、AMPK、SREBP-1c蛋白的表達

3 討論

GLP-1是一種葡萄糖依賴性腸促胰素。大量研究結果顯示，其對T2DM、代謝綜合征及非酒精性脂肪肝有明顯的改善作用[4，10-12]。GLP-1受體激動劑可顯著降低糖尿病患者體重、空腹血糖，糖化血紅蛋白水平[13]，促進β細胞增殖，抵制細胞凋亡[14]。作為GLP-1受體激動劑的利拉魯肽，已廣泛應用于T2DM的降糖治療中。研究顯示，利拉魯肽具有改善胰島素抵抗及脂質代謝紊亂作用[15-16]，但其對減輕肝臟脂質沉積的作用機制缺乏統一觀點[17]，目前主要認為其可能通過脂肪酸合成過程影響肝臟脂質平衡，改善肝臟的脂肪過度沉積。

本研究采用高脂飲食和STZ誘導復制T2DM大鼠模型，糖尿病組大鼠血糖和血脂水平較對照組升高，提示糖尿病組大鼠存在糖脂代謝異常，經利拉魯肽治療后，血糖和血脂均明顯恢復，證實利拉魯肽改善大鼠糖脂代謝的作用。此外，通過大鼠肝臟組織油紅O染色結果顯示，利拉魯肽可同時減輕T2DM大鼠肝臟的脂質沉積，與相關研究結果一致。

本研究結果顯示，脂聯素與肝臟的胰島素抵抗呈負相關，通過與其受體結合激活AMPK，從而加速細胞內的脂質代謝[7]。T2DM個體中脂聯素明顯降低，表明脂聯素可能是T2DM個體肝臟脂肪過度沉積的關鍵因子，但其相關機制尚未明確。因此本研究對其相關機制進行探討，推測利拉魯肽在T2DM大鼠中上調脂聯素，一方面通過激活Thr172p-AMPK、AMPK加速脂質代謝[18]；另一方面通過下調SREBP-1c的表達，減少脂肪酸的合成，從而減少T2DM的肝臟脂質沉積。本研究結果顯示，利拉魯肽能提高T2DM大鼠血清的脂聯素水平，提示利拉魯肽可能通過脂聯素通路改善肝臟的脂質代謝。本研究中Western blot檢測結果與血清檢測結果一致。本研究結果顯示，利拉魯肽通過激活脂聯素-AMPK通路，抑制SREBP-1c的表達，減輕T2DM大鼠肝臟的脂質沉積。

然而，GLP-1受體激動劑調控肝臟脂質代謝的過程是多通路、多方面的，GLP-1受體激動劑也可能通過激活MAPK通路，促進脂肪酸氧化，逆轉肝細胞脂肪變性[19-20]。近期有體外研究顯示，在LO2細胞中，利拉魯肽能夠通過增加細胞自噬作用，從而減少肝臟的脂肪沉積[21]。

GLP-1受體激動劑能夠改善患者的脂肪沉積的報道越來越多[22-23]，且主要通過2個途徑：①抑制脂肪合成和沉積；②刺激脂肪酸氧化來改善肝臟的脂質沉積，但具體機制并未完全闡述明晰。作為GLP-1類似物的利拉魯肽，在T2DM及其并發癥的治療方面具有非常好的前景，且目前利拉魯肽已經是減輕體重的一線用藥，但其分子生物學機制仍不清楚。

雖然利拉魯肽可通過抑制脂質合成來改善T2DM大鼠的非酒精性脂肪肝，但是利拉魯肽是否可以通過刺激脂肪酸氧化或加強肝臟脂質動員來發揮作用，是本研究后續要探討的問題。