MicroRNA-29b對肝纖維化及肝星狀細胞增殖、凋亡的影響

（河南大學淮河醫院 感染科，河南 開封 475000）

肝纖維化并非一種獨立疾病，而是伴發于多種慢性肝病的肝臟病變。近年來，我國肝纖維化發病率逐漸上升，若不及時治療，肝內纖維組織大量增生，由肝纖維化發展到肝硬化，嚴重威脅患者的生命健康[1]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC）的激活在肝纖維化發展過程中發揮重要作用[2]。MicroRNA（miRNA）主要調控細胞的增殖、分化、凋亡。較多研究證實，miRNAs與HSC向成纖維細胞發展有關，其中miR-29b在多種腫瘤中表達下調，被認為是腫瘤抑制型miRNA[3-4]。關于miR-29b與肝纖維化的研究已有較多報道，但是HSC中miR-29b的研究較少[3-4]。本研究通過CCl4復制肝纖維化模型，旨在探究miR-29b在肝纖維化過程中的作用及其對HSC的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠20只，8周齡，體重200 g，由上海醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SYXK（滬）2014-0004，所有動物在統一環境中飼養，溫度25℃，濕度65%，嚴格按照動物飼養規則進行喂養。

肝星狀細胞HSC-T6、LX-2購自北京醫科大學肝病研究中心，來源于美國標準生物品收藏中心，保存于-80℃。

1.2 主要試劑與儀器

CCl4（美國RD公司）使用前加入中性菜籽油進行稀釋，調整濃度為600 ml/L。兔抗大鼠轉化生長因 子 -β1（tansforming growth factor-β1, TGF-β1）、SAMD3（sterile alpha motif domain containin protein 3）單克隆抗體一抗、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）標記山羊抗兔二抗購自美國Santacruz公司，RNA提取試劑盒（北京生化科技有限公司），逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），BCA測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），LipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司，miR-29b siRNA正向引物：5'-TGCGCTAGCACCATT TGAAATC-3'；反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCG AGGTATT-3'），光學顯微鏡（上海光學儀器廠），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國BioRed公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復制 將大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠經腹部注射60%3 ml/kg CCl4，2次/周，對照組以同樣方式注射等量生理鹽水。在第0、6和12周，大鼠禁食12 h，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉，切開腹部皮膚，取出肝臟組織，留取一部分在4%多聚甲醛中固定，另一部分保存在-80℃冰箱備用。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining）大鼠肝組織行HE染色。常規制備石蠟切片浸入二甲苯固定30 min，在質量分數為100%、95%、85%和75%的乙醇溶液中分別脫水5 min，流水沖洗后，加入蘇木精染色10 min，浸入1%鹽酸后用蒸餾水沖洗。均加入伊紅液染色3 min，依次在75%、85%、95%和100%乙醇溶液中脫水2 min，加入二甲苯透明處理，滴加中性樹脂封片，放置于顯微鏡下觀察，選取5個視野計算纖維化面積，無纖維化為0分，纖維化面積＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 采 用qRT-PCR檢測肝組織中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因的表達。取出冷凍肝組織，用無菌剪刀將組織剪碎，采用RNA提取試劑盒提取肝臟總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作，將RNA逆轉錄為cDNA，qRT-PCR引物由廣州Invitrogen公司合成，引物序列見表1。反應體系：10×cDNA模板1μl，正反向引物各 1μl，H2O 8μl，10μl 2×SYBR Mix。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環，72℃繼續延伸10 min。在CFX manager 3.0軟件上以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法行基因相對定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blot檢測 采用Western blot檢測肝組織中TGF-β1、SAMD3的蛋白表達。將肝臟組織剪碎后加入蛋白裂解液，在冰上反應30 min，離心后收集上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，制備8%分離膠、12.5%濃縮膠，蛋白上樣量統一為30μg，電泳開始時電壓設置為80 V，進入分離膠后，電壓調整為120 V，電泳結束后轉移蛋白凝膠至PVDF膜上，轉膜反應在冰上進行，電壓設置為100 V，轉膜反應1 h，加入TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶，室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀釋液（TGF-β1、SAMD3抗體），4℃震蕩過夜，PBST清洗3次，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，PBST清洗。凝膠成像儀觀察蛋白的表達。

1.3.5 miR-29b轉染HSC-T6、LX-2細胞 采用含10% FBS的DMEM培養基，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中培養HSC-T6、LX-2細胞。細胞貼壁生長后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，生長至80%時，加入DMEM培養基終止消化。將細胞隨機分為空白對照組、miR-29b轉染組、陰性轉染組。miR-29b轉染組、陰性轉染組參照轉染試劑盒分別轉染miR-29b siRNA和無意義對照序列，置于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h。

1.3.6 MTT法 采用MTT法檢測HSC-T6、LX-2細胞的增殖。收集培養后的細胞制備單細胞懸浮液，調整細胞密度為5×104個/ml，置于37℃、5% CO2培養箱中分別培養12、24、48和72 h，加入10μl MTT孵育4 h，加入100μl DMSO溶液，在570 nm波長處測定吸光度值（OD值）。細胞抑制率=（OD實驗組-OD空白對照組）/OD空白對照組×100%。

1.3.7 流式細胞術 采用流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡的變化。收集培養后的細胞制備單細胞懸浮液，調整細胞密度為5×104個/ml，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，當細胞生長至80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞后加入預冷PBS溶液洗滌，70%乙醇溶液中固定1 h，PBS清洗，加入PI染色重懸后置于流式細胞儀中檢測細胞周期變化。在細胞懸浮液中加入Annexin V-APC，室溫下黑暗中孵育15 min，用細胞流式儀檢測細胞凋亡情況。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝纖維化狀況

HE染色結果顯示，對照組大鼠肝臟組織細胞形態正常結構完整，呈四周放射樣整齊排列；模型組大鼠肝組織出現纖維增生，結構遭到破壞，存在炎癥細胞浸潤，隨著時間的延長肝纖維化程度逐漸加重。對照組第0周大鼠肝組織纖維化評分為（0.00±0.00）分，模型組第0、6和12周大鼠肝組織纖維化評分分別為（0.97±0.13）、（1.66±0.15）和（2.57±0.32）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=4.032，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，模型組第6周大鼠肝組織纖維化評分高于模型組第0周（P＜0.05）；模型組第12周大鼠肝組織纖維化評分高于模型組第6周（P＜0.05）。見圖 1、2。

2.2 各組大鼠肝組織中 miR-29b、TGF-β1、SAMD3表達水平

對照組、模型組大鼠不同時間miR-29b、TGF-β1、SAMD3相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2和圖3、4。

2.3 miR-29b對HSC-T6、LX-2細胞增殖的影響

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組12、24、48和72 h的HSC-T6細胞抑制率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞抑制率有差別（F=36.675，P=0.000）；②3組細胞抑制率有差別（F=9.566，P=0.000）；③3組細胞抑制率變化趨勢有差別（F=48.755，P=0.000）。

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組12、24、48和72 h的LX-2細胞抑制率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞抑制率有差別（F=35.258，P=0.000）；②3組細胞抑制率有差別（F=5.810，P=0.000）；③3組細胞抑制率變化趨勢有差別（F=12.908，P=0.000）。見表3和圖5。

圖1 各組大鼠肝組織 （HE×100）

圖2 各組大鼠肝組織纖維化評分比較 （n =10，±s）

圖3 各組大鼠肝組織中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表達水平比較 （n =10，±s）

表2 各組大鼠肝組織中miR-29b、TGF-β1、SAMD3表達水平比較 （n =10，±s）

表2 各組大鼠肝組織中miR-29b、TGF-β1、SAMD3表達水平比較 （n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組第0周比較，P ＜0.05；3）與模型組第6周比較，P ＜0.05

SAMD3基因 蛋白 基因 蛋白對照組 0.98±0.10 0.26±0.04 0.29±0.03 0.23±0.03 0.36±0.06模型組第0周 0.78±0.151） 0.43±0.081） 0.41±0.061） 0.39±0.061） 0.43±0.051）模型組第 6周 0.67±0.141）2） 0.54±0.091）2） 0.78±0.111）2） 0.46±0.111）2） 0.72±0.091）2）模型組第 12 周 0.52±0.121）2）3） 0.82±0.061）2）3） 1.12±0.141）2）3） 0.76±0.141）2）3） 1.17±0.071）2）3）F值 11.417 58.591 79.247 27.559 143.552 P值 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 TGF-β1組別 miR-29b

2.4 miR-29b對HSC-T6、LX-2細 胞 周 期 的影響

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組HSC-T6、LX-2細胞G1期比例比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=5.048和3.605，P=0.014和0.041）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，HSC-T6、LX-2細胞miR-29b轉染組G1期比例[（62.34±13.66）%和（56.83±8.28）%]均高于空白對照組[（49.73±7.56）%和（50.34±9.65）%]、陰性轉染組[（48.23±10.64）%和（46.79±8.35）%]。見圖6。

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組HSC-T6、LX-2細胞S期比例比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=14.091和4.418，P=0.000和0.022）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，HSC-T6、LX-2細胞S期比例[（25.37±6.24）%和（30.36±5.47）%]低于空白對照組[（38.51±6.64）%和（39.65±9.64）%]、陰性轉染組 [（39.76±7.23）%和（36.74±5.52）%]。見圖6。

圖4 各組大鼠肝組織中miR-29b、TGF-β1、SAMD3蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

2.5 miR-29b對HSC-T6、細胞凋亡的影響

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組HSC-T6、LX-2細胞凋亡率比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=100.553和97.438，均P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-29b轉染組HSC-T6、LX-2細胞凋亡率[（23.64±6.37）%和（20.13±5.26）%]高于空白對照組[（3.16±0.87）%和（3.83±0.76）%]、陰性轉染組[（3.07±0.75）%和（2.98±0.72）%]。見圖 7。

表3 轉染后HSC-T6、LX-2細胞抑制率比較 （%，±s）

表3 轉染后HSC-T6、LX-2細胞抑制率比較 （%，±s）

注：?與空白對照組、陰性對照組比較，P ＜0.05

LX-2 12 h 24 h 48 h 72 h 12 h 24 h 48 h 72 h空白對照組 6.13±0.87 6.26±0.79 6.14±0.88 6.28±0.71 5.38±0.62 5.64±0.34 5.49±0.51 5.52±0.46陰性轉染組 7.41±0.92 6.83±0.89 6.25±1.02 6.48±0.84 5.83±0.76 5.65±0.77 5.76±0.68 5.74±0.79 miR-29b轉染組 13.95±2.37? 24.44±3.85? 37.57±6.16? 28.17±8.15? 11.33±2.36? 21.16±4.49? 29.47±5.06? 18.69±3.18?HSC-T6組別

圖5 HSC-T6、LX-2細胞抑制率比較 （±s）

2.6 miR-29b對HSC-T6、LX-2細胞中TGF-β1、SAMD3表達的影響

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組HSC-T6細胞中TGF-β1、SAMD3蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=29.988和16.315，均P=0.0000）?？瞻讓φ战M、陰性轉染組、miR-29b轉染組LX-2細胞中TGF-β1、SAMD3蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=44.951和50.643，均P=0.000）。見表4和圖8。

圖6 HSC-T6、LX-2細胞周期

圖7 miR-29b對HSC-T6、LX-2細胞凋亡的影響

表4 HSC-T6、LX-2細胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表達水平比較 （±s）

表4 HSC-T6、LX-2細胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與空白對照組、陰性對照組比較，P ＜0.05

組別HSC-T6 LX-2 TGF-β1 SAMD3 TGF-β1 SAMD3空白對照組 0.28±0.05 0.31±0.04 0.25±0.04 0.22±0.05陰性轉染組 0.31±0.26 0.30±0.05 0.29±0.05 0.26±0.09 miR-29b轉染組 0.82±0.05? 0.88±0.15? 0.78±0.09? 0.94±0.04?

空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組HSC-T6細 胞 中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基 因相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=10.784、21.085和24.096，均P=0.000）。空白對照組、陰性轉染組、miR-29b轉染組LX-2細胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因相對表達量的比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=37.022，30.513和36.648，均P=0.000）。見表5和見圖9。

圖8 HSC-T6、LX-2細胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表達水平比較 （±s）

表5 HSC-T6、LX-2細胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表達水平比較 （±s）

表5 HSC-T6、LX-2細胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表達水平比較 （±s）

注：?與空白對照組、陰性對照組比較，P ＜0.05

LX-2 miR-29b TGF-β1 SAMD3 miR-29b TGF-β1 SAMD3空白對照組 0.82±0.05 0.36±0.04 0.29±0.04 0.86±0.65 0.33±0.04 0.23±0.05陰性轉染組 0.80±0.09 0.738±0.05 0.31±0.05 0.79±0.87 0.34±0.05 0.26±0.09 miR-29b轉染組 0.42±0.05? 0.80±0.03? 0.79±0.15? 0.35±5.37? 0.78±0.09? 0.75±0.04?HSC-T6組別

圖9 HSC-T6、LX-2細胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表達水平比較 （±s）

3 討論

肝纖維化主要由不同因子共同作用下破壞肝細胞外基質降解、分泌的平衡狀態，導致細胞外基質逐漸沉積于肝細胞間造成肝臟損傷。引起肝纖化的因素較多，一般能夠引起慢性肝病的因素均能導致肝纖化。研究顯示，其病因主要包括感染性、代謝缺陷、化學毒性、免疫性肝病等方面[5]。近年來肝纖維化研究取得了較好的成果，較多臨床研究證實肝硬化能夠逆轉，其中HSC在逆轉過程中發揮重要作用，并且miRNA-29b也參與其中[6]。最新研究證實，在肝硬化恢復階段激活后的HSC主要通過凋亡機制進行調節[7]。因此，了解肝纖維化的形成機制、HSC凋亡機制，以及與miRNA-29b的關系對肝纖維化臨床治療具有一定的參考意義。

miRNA屬于內源非編碼單戀分子，通過與靶基因mRNA上3’配對結合抑制mRNA的轉錄。最近研究發現，miRNA與腫瘤的發生、發展密切相關，參與腫瘤增殖、周期改變及遷移侵襲[8]。miR-29b基因屬于microRNA一員，在胚胎組織中幾乎不表達，在成熟組織細胞中廣泛表達。較多研究顯示，miR-29b在肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達下調[9]。臨床研究顯示，與正常人相比，肝病患者血清miR-29b水平降低，且降低程度與病情嚴重程度呈正相關，表明miR-29b參與肝纖維化病程的發展[10]。體外研究顯示，上調miR-29b能夠促進膠原纖維生成，使星狀細胞發生活化，加速胞外基質的生成[11]。國內外研究證實，TGF-β1/SAMDs通路參與肝纖維活化形成過程，TGF-β1與細胞膜受體結合后發生磷酸化，通過SAMD3等信號分子進入細胞核中，與轉錄因子結合進行基因調控[12-13]。動物研究發現，TGF-β1刺激HSC后miR-29b過表達，SAMD3受抑制表達量下降，說明miR-29b可能位于TGF-β1/SAMDs通路上游[14]。本研究為證實miR-29b在肝纖維化中的作用，通過HE染色發現肝組織隨著模型復制時間的延長，纖維化比例逐漸升高，表明模型復制成功，大鼠肝臟組織逐漸形成纖維化，且組織病變特征符合肝纖維化病理特征。本研究結果顯示在纖維化形成過程中，miR-29b基因表達水平逐漸降低，TGF-β1、SAMD3表達水平逐漸升高，推測抑制miR-29b的表達能夠增強TGF-β1/SAMDs信號通路，進而促進肝纖維化，與國內學者研究結果相似[15]。

正常狀態下，HSC為靜止狀態，當肝臟受到刺激后迅速激活HSC，數量迅速升高，生成大量纖維細胞，破壞細胞外基質合成、降解[16]。在肝纖維化恢復階段，活化HSC數量明顯降低，誘導HSC凋亡[17]。國外學者研究顯示，miR-15b可以下調線粒體凋亡蛋白Bcl-2，上調Caspase-3，誘導HSC細胞凋亡[18]。細胞周期檢測結果顯示，miR-16能夠抑制周期蛋白D1表達，使其在G1期增殖受阻滯，抑制細胞增殖，誘導凋亡[19]。體外研究結果顯示，促纖維化細胞因子能夠使HSC中miR-21上調，進而促進PTEN的表達，抑制HSC激活誘導其凋亡[20]。國外相關研究結果顯示，miR-29b為腫瘤抑制因子，能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡，同時抑制細胞侵襲能力[21]。國內研究報道，miR-29b能夠通過抑制PTEN基因促進乳腺癌細胞遷移、凋亡[22]。本研究結果表明，轉染miR-29b后 HSC-T6細胞增殖明顯受到抑制，尤其在48 h時抑制最為明顯。流式細胞儀檢測結果顯示，細胞在G1期增殖受到阻滯，G1期細胞數高于空白對照組、陰性轉染組，而S期細胞數量降低。細胞流式儀檢測結果顯示，細胞凋亡率增加，提示轉染miR-29b后能夠抑制HSC-T6、LX-2細胞增殖，誘導HSC-T6、LX-2細胞早期凋亡，抑制肝纖維化。

本研究也存在一定的局限性，選取的模型時間較少，后期需要設置不同時間的模型組進一步驗證，此外并未對肝纖維化大鼠進行給藥治療，以便探究miR-29b在肝纖維化恢復期的作用?？傊S著大鼠肝纖維化加重，miR-29b表達量逐漸降低，可抑制肝星狀細胞增殖，誘導凋亡。