MicroRNA-486和TGF-β1對人主動脈瓣膜鈣化的影響及其機制研究*

（上海健康醫學院附屬周浦醫院，上海 201318）

近年來，全球鈣化性主動脈瓣疾病（calcific aortic valve disease, CAVD）的發病率不斷上升，成為老齡人最常見的心臟瓣膜疾病之一[1-3]。最新研究提示，多種microRNA（miRNA）在主動脈瓣鈣化及瓣膜內異位骨化中起重要調控作用[4]，國外學者HEATH等[5]亦在研究中闡述了miRNA與CAVD的聯系。但筆者查閱文獻發現miRNA-486與CAVD的研究較少，現有研究發現其多數功能作用與轉錄生長因子-β1（transcription growth factor-β1, TGF-β1）相關，為 CAVD進程中的靶基因及作用機制仍未明確[3-5]。因此，本研究擬通過轉染miRNA-486模擬物和抑制物，進一步驗證其作用，以期為CAVD的治療尋找一個潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

1.1.1 細胞及試劑 人主動脈瓣膜間質細胞（human aortic valve interstitial cells, VICs）由上海健康醫學院附屬周浦醫院提供，維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸、茜素紅購自美國Sigma生物公司，膠原酶、SMAD3抗體、TGF-β1抗體購自杭州遠方生物科技有限公司，高糖DMEM培養基、青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（ABI7900HT）、逆轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，日本Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），Eppendorf基因擴增儀、Leica倒置熒光相差顯微圖像系統、組織切片機、組織包埋機購自上海賽默飛世爾科技有限公司，多功能酶標儀則（美國BioTek公司），Odyssey雙色紅外激光成像系統（美國LICOR公司），免疫熒光試劑包括多聚甲醛、Triton X-100、BSA、PBS、DAPI、抗淬滅封片劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司，核酸蛋白電泳設備（上海生工生物工程股份有限公司），各種離心及冷藏設備（低溫冰箱和液氮罐）（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用膠原酶溶解人主動脈瓣組織后，刮取內皮細胞層再次溶解制成細胞懸液。常規培養于高糖DMEM培養基，添加10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和鏈霉素，控制培養箱條件為37℃、5%二氧化碳CO2恒溫。密切觀察12 h后改用鈣化培養基（含10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）培養細胞，觀察兩組細胞狀態，每隔2天更換培養液，當細胞生長至70%～80%時，胰蛋白酶消化傳代，取傳代后3～7代細胞進行后續實驗。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測 初步應用TargetScan 6.2版本等生物信息學軟件檢索miRNA-486靶基因，結果顯示TGF-β1基因可能是其潛在靶基因。收集第3代VIC細胞按1×106個/孔接種于6孔板，利用PCR法獲取VIC細胞中的cDNA模板，構建包含miRNA-486結合位點TGF-β1基因3’-UTR的序列，插入pMIR-REPORT luciferase報告載體中，經限制性內切酶處理后，純化鑒定。構建獲得的TGF-β1-WT（野生型）重組載體質粒和TGF-β1-Mut（突變型）重組載體質粒，所有構建獲得的表達質粒經酶切和測序鑒定。按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行操作，將上述重組質粒載體和miR-486 mimic、miR-486 mimic NC、miR-486 Inhibitors、miR-486 Inhibitors NC（美國Invitrogen公司合成）共轉染293T細胞（生長狀態良好），24 h后行雙熒光素酶報告基因檢測。以熒光素為底物，檢測螢火蟲熒光素酶活性，加入Stop&Glo8試劑，檢測海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內參照，同時加入抑制熒光素酶催化熒光素發光的物質，計算各組細胞內的相對熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。實驗操作重復3次。

1.2.3 miRNA-486轉染及分組 分別將miR-486 mimics、miR-486 mimics NC、miR-486 mimic Inhibitors、miR-486 mimic Inhibitors NC通過Lipofectamine 2000轉染第3代VICs細胞，分為4組。PBS洗滌3次后，各組按量加入DEPC處理的水，輕蕩混勻。調整細胞狀態，在500μl無血清、無雙抗的轉染專用opti-MEM培養基中加入Lipofectamine 2000，作用5 min。輕輕吹打，室溫靜置20 min。棄培養皿中細胞上清樣，配成0.5 ml轉染液，PBS清洗培養皿中細胞2次，加入無血清的1.5 ml opti-MEM。放入培養箱孵育6 h，棄轉染液，PBS洗1次，加入成骨誘導液繼續孵育。

1.2.4 Western blot檢測 采用Western blot檢測內源性TGF-β1蛋白表達水平。選取第3代細胞，轉染miRNA并成骨誘導后第7天，取6孔細胞培養板，PBS清洗2次，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入細胞裂解液，搖勻，靜置20 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液置于新的離心管中。用BCA蛋白質濃度測定試劑盒進行蛋白定量，樣品按量加入96孔的蛋白標準孔，再加入200μl BCA工作液，反應30 min，SDS-PAGE（8%分離膠，5%濃縮膠）凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h后分別加入TGF-β1抗體稀釋液（1∶1 000），4℃過夜孵育，TBS洗膜3次，5 min/次。室溫下加入1∶3 000的二抗稀釋液（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG）孵育1.5 h，TBS洗3次。

1.2.5 茜紅素染色 沉積的鈣可與茜素紅發生顯色反應，細胞外基質被染成橘紅色，而細胞本身被染成粉紅色。用100 ml蒸餾水溶解1 g Tris，滴管緩慢滴加HCl到溶液中，觀察溶液酸堿度，當pH=8.3時，向溶液中加入0.1 g茜紅素粉末，配置為pH=8.3的0.1%茜素紅-Tris-HCl工作液。同時，取轉染后細胞，在100倍倒置顯微鏡下觀察消化后細胞的形態變化，用血球計數板計數，24孔板加入爬片，細胞2萬個/孔；貼壁加入PBS清洗2遍，95%乙醇固定。10 min后，雙蒸餾水清洗3次，加入配置好的工作液，37℃恒溫作用30 min。將茜素紅染液用0.22μm濾紙過濾，加入染液覆蓋住底孔，室溫染色放置5 min，PBS漂洗3次，風干，甘油明膠封片，倒置顯微鏡觀察鈣結節染色情況，橘紅色礦化結節為陽性結果。根據實驗需要，在加入成骨誘導液7和14 d時進行染色；每組設3個重復，每樣本隨機取1個視野，比較各組間差異。

1.2.6 堿性磷酸酶活性測定 PNPP制備：5.4 ml Assay Buffer溶解2片PNPP，制成5 mmol工作液。ALP酶制備：1 ml Assay Buffer 加入ALP酶。取160μl Assay Buffer混入40μl PNPP制成1 mmol標準品。標準孔中每個梯度加入0、4、8、12、16和20μl Assay Buffer，吹打搖勻后孵育5 min，加入10μl ALP酶。清洗轉染后細胞，加入50μl Assay Buffer，13 000 r/min離心3 min。取20μl樣品，加入Assay Buffer至80μl，加入50μl/孔 PNPP反應液50μl，25℃避光作用60 min，加入20μl終止液混勻，于405 nm處測定吸光度值，制作標準曲線并計算ALP活性。

1.2.7 qRT-PCR 采用 qRT-PCR 檢測 TGF-β1、SMAD3，以及成骨相關因子RUNX2、骨鈣素。選取第3代細胞，于轉染后24 h、2 d和7 d，檢測各組細胞TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA相對表達量。棄用培養基后，PBS清洗細胞3次，加入Trizol試劑，裂解細胞。反復吹打后，將裂解液轉移至無RNA酶的離心管中，振蕩離心10 min，取上清液。將上清液轉移至另一離心管中（無RNA酶），加入氯仿，反復震蕩，靜置10 min，11 200 r/min離心，待樣品分層后取上清，同時加入等體積異丙醇，混勻后低溫過夜。次日取出，溶解后離心10 min，收集沉淀，用75%乙醇（DEPC溶解）清洗搖勻，棄上清，風干，取2μl總RNA溶解液稀釋。引物長度18～22 bp，TGF-β1、SMAD3、RUNX2、骨鈣素擴增片段長度分別為185、224、233和202 bp以GAPDH為內參，檢測各目的基因的Ct值，采用公式2-△△CT計算各目的基因的相對表達量，操作重復3次，內參基因及目的基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8 免疫熒光 采用免疫熒光檢測各組TGF-β1、RUNX2蛋白相對表達量。各組細胞成骨誘導后第14天，棄去培養基，用PBS清洗2、3次，4%多聚甲醛固定1 h，0.01 mol PBS浸洗3次，3 min/次。采用0.1% Triton X-100透膜作用15 min，0.01 mol PBS浸洗3次；1% BSA-PBS封閉，傾去，滴加稀釋后的一抗（1∶100），放入濕盒中4℃避光過夜。次日拿出，棄一抗，0.01 mol PBS沖洗3次，滴加對應熒光標記二抗（1% BSA-PBS以1∶100比例稀釋），37℃孵育30 min，棄二抗，PBS沖洗后用DAPI復染細胞核，染色約20 min，PBS沖洗3次，3 min/次。抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1是miRNA-486的直接靶基因

熒光素酶活性檢測結果顯示，miR-486 mimic、miR-486 mimic NC組、miR-486 mimic組及miR-486 mimic NC組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=6.052，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic+TGF-β1-WT共轉染組細胞的熒光素酶活性強度低于miR-486 mimic NC組（P＜0.05）。進一步轉染miR-486 Inhibitors+TGF-β1-WT、miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-WT、miR-486 Inhibitors+TGF-β1-Mut和 miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-Mut至293T細胞，經方差分析，差異有統計學意義（F=5.006，P=0.003）；miR-486 Inhibitors +TGF-β1-WT共轉染組細胞的熒光素酶活性強度高于miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-WT共 轉 染 組（P＜0.05）。 見 表 2和圖1。

表2 雙熒光素酶報告基因檢測結果 （±s）

表2 雙熒光素酶報告基因檢測結果 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 TGF-β1-WT TGF-β1-Mut miR-486 mimic組 0.56±0.031） 1.13±0.06 miR-486 mimic NC 組 1.00±0.05 1.17±0.07 miR-486 Inhibitors組 1.30±0.032） 1.29±0.09 miR-486 Inhibitors NC 組 0.64±0.02 1.33±0.06

圖1 雙熒光素酶報告基因檢測結果比較 （±s）

2.2 miRNA-486對內源性TGF-β1蛋白表達的影響

Western blot檢測顯示，miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組的TGF-β1蛋白相對表達量分別為（87.31±3.11）、（103.34±4.38）、（118.15±3.46）和（106.07±4.57），經方差分析，差異有統計學意義（F=4.148，P=0.028）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic組TGF-β1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組 TGF-β1蛋白水平較miR-486 Inhibitors NC 組升高（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 各組TGF-β1蛋白的表達水平比較 （±s）

2.3 各組鈣鹽沉積情況

茜素紅染色結果顯示，miR-486轉染后，培養第14天時，miR-486 mimic NC組可見著色小點形成，少量橘紅色沉淀；miR-486 mimic組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；miR-486 Inhibitors NC組橘紅色沉淀較少；miR-486 Inhibitors組鈣鹽沉積減少。見圖3。

2.4 各組ALP活性比較

miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組ALP活性分 別 為（6.23±0.31）、（3.96±0.22）、（2.07±0.14）和（4.15±0.27）mmol/（min·mg），經方差分析，差異有統計學意義（F=7.361，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic組ALP活性高 于 miR-486 mimic NC組（P＜0.05）；與 miR-486 Inhibitors NC組比，miR-486 Inhibitors組ALP活性下 降（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors NC 組 與 miR-486 mimic NC組ALP活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；miR-486 mimic組ALP活性高于miR-486 Inhibitors組（P＜0.05）。見圖 4。

圖3 各組miR-486轉染后14 d鈣鹽沉積情況 （茜素紅染色×100）

圖4 各組成骨誘導14 d后ALP活性比較 （±s）

2.5 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達水平

miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors 組、miR-486 Inhibitors NC 組 TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic組TGF-β1和SMAD3 mRNA表達水平低于miR-486 mimic NC組（P＜0.05），Runx2和 骨 鈣 素 mRNA 高 于 miR-486 mimic NC 組（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組TGF-β1和SMAD3 mRNA表達水平高于miR-486 Inhibitors NC組（P＜0.05），RUNX2和骨鈣素mRNA低于miR-486 Inhibitorsost NC組（P＜0.05）；miR-486 mimic NC組與miR-486 Inhibitors NC組各mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3和圖5。

表3 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達水平比較 （±s）

表3 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達水平比較 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 TGF-β1 SMAD3 RUNX2 骨鈣素miR-486 mimic NC 組 1.07±0.06 0.94±0.05 1.36±0.01 0.86±0.03 miR-486 mimic 組 0.68±0.041） 0.57±0.071） 1.5±0.021） 1.39±0.021）miR-486 Inhibitors NC組 1.12±0.05 1.06±0.06 1.44±0.03 0.79±0.03 miR-486 Inhibitors 組 1.45±0.042） 1.33±0.052） 1.15±0.012） 0.62±0.022）F值 4.327 5.378 3.805 3.524 P值 0.001 0.000 0.011 0.016

圖5 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達水平比較 （±s）

2.6 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2的蛋白表達

培養14 d后經免疫熒光檢測，對比miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組RUNX2蛋白表達水平，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic組Runx2蛋白表達水平高于miR-486 mimic NC組，熒光增強（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組較miR-486 Inhibitors NC組熒光強度降低，僅表達少量RUNX2蛋白（P＜0.05）。各組TGF-β1和SMAD3蛋白表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，miR-486 mimic組TGF-β1、SMAD3蛋白表達水平低于miR-486 mimic NC組，熒光強度降低（P＜0.05）；而轉染miR-486 Inhibitors后，miR-486 Inhibitors組 TGF-β1、SMAD3熒光強度增加，蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表4和圖 6、7。

表4 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達水平比較 （±s）

表4 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達水平比較 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 RUNX2 SMAD3 TGF-β1 miR-486 mimic 組 103±3.721） 62±4.461） 71±2.641）miR-486 mimic NC 組 81±4.84 78±5.57 92±3.25 miR-486 Inhibitors NC組 76±4.66 85±4.38 89±3.03 miR-486 Inhibitors組 54±3.692） 109±4.112） 113±2.912）F值 7.009 9.713 3.962 P值 0.000 0.000 0.008

圖6 各組TGF-β1、Smad3、Runx2蛋白免疫熒光強度

圖7 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達水平比較 （±s）

3 討論

CAVD發病率隨年齡增長而升高，是一種常見的老年慢性疾病，病情呈緩慢進展趨勢。到中晚期時，CAVD可顯著增高心肌梗死發生率、心血管死亡率[6-7]；盡管經導管主動脈瓣置換術治療主動脈瓣狹窄已取得一定成效，但是在減緩CAVD發生、阻止病情進展上仍未達到預想效果。主動脈瓣鈣化到主動脈瓣狹窄是一個相對漫長的過程，可研究的作用因子較多，病情延緩可依靠持續的藥物作用，因而藥物的早期干預已成為當前臨床治療CAVD的目標之一[8]，而尋找與CAVD相關的靶基因則是研究新型有效藥物的方向之一。目前，已有研究在鈣化性主動脈瓣狹窄動物實驗中發現某些microRNA變化與異位骨化、炎癥細胞激活等現象相關[9]。國外學者OHUKAINEN等[10]通過體外培養的人THP-1巨噬細胞，檢測microRNA靶預測數據庫與瓣膜microRNA表達譜結合度，證實micro125b、趨化因子CCL4的水平含量與CAVD關系密切。盡管證實多種microRNA具有調控發育、增殖、凋亡、代謝和免疫等多方面的生物學作用[11]，但其參與調控CAVD的作用及可能機制仍屬于國內較新的研究。

TGF-β在炎癥、組織修復及胚胎發育等方面有不可或缺的調控作用，其主要類型分為TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1在細胞和組織中含量較為豐富，其調控的信號通路多為Smads通路，可結合受體TβRII使SMAD2和SMAD3磷酸化，進而調節靶基因的轉錄[12]。在本研究中，雙熒光素酶報告基因系統結果顯示，miR-486 mimic+TGF-β1-WT共轉染組熒光素酶活性強度降低，而miR-486 Inhibitors+TGF-β1-WT共轉染組細胞的熒光素酶活性強度升高，對照組間無差異，這提示TGF-β1可能是miR-486的直接靶基因。筆者采用Western blot檢測miR-486 mimic、miR-486 Inhibitors轉染后，鈣化性VICs細胞中TGF-β1的表達差異，結果提示與各對照組相比，miR-486 mimic組TGF-β1較低，miR-486 Inhibitors組則相反。以上結果進一步證明TGF-β1可能是miR-486的靶基因，miR-486的某些作用與TGF-β1存在密切聯系。學者MARTíNEZ-MICAELO等[13]認為，miR-486與miR-718在主動脈瓣疾病的發生中扮演重要角色，其靶基因可能是TGF-β1、RUNX2，與本研究結論一致。

茜素紅染色可顯示成骨細胞培養中礦化結節的數量、大小及形態，實驗中觀察到的深紅色帶色化合物即為茜素紅與鈣結合而成的顯色物質，常用于判斷體外誘導細胞向成骨細胞分化程度的高低及成骨活性的大小[14]。在本實驗中，對鈣化培養14 d后的各組細胞進行茜素紅染色，結果顯示，miR-486 mimic組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；miR-486 Inhibitors組鈣鹽沉積減少，提示miR-486可能具有促使VICs細胞成骨分化的作用，可加速細胞鈣化。堿性磷酸酶作為成骨細胞和骨組織的標志物，在主動脈鈣化瓣膜及體外培養細胞成骨分化后，其表達增強，含量升高。在ALP實驗中，可發現轉染miR-486 mimic后細胞ALP活性增加，而miR-486 Inhibitors轉染后卻降低，此現象提示，miR-486能增強VICs細胞中ALP的活性，即能促進VICs細胞鈣化。

RUNX2是骨發生過程中調節間充質干細胞成骨分化至成熟的重要轉錄因子之一，亦是成骨細胞特異轉錄因子，在大部分CAVD患者細胞中呈高表達狀態，常作為骨代謝狀態的一種檢測指標[15]。SMAD3作為TGF-β1的下游因子，聯合TGF-β1形成TGF-β1-SMAD3信號通路可介導多種生理反應，作用廣泛。本研究采用qRT-PCR和免疫熒光檢測各組成骨相關因子及可能信號通路中基因的表達含量。結果提示，TGF-β1、SMAD3 mRNA和蛋白水平在miR-486 mimic組降低，在miR-486 Inhibitors組中升高，對照組無差異；miR-486 mimic組RUNX2、骨鈣素mRNA水平較高，miR-486 Inhibitors組降低，且RUNX2蛋白在miR-486 mimic組表達較高；上述現象均提示miR-486能下調TGF-β1的表達，可能通過TGF-β1-SMAD3信號轉導，促進RUNX2、骨鈣素的表達和活性，誘導間質細胞向成骨細胞分化，發生異位骨化。

本研究尚有不足，TGF-β1介導的信號通路較復雜，未能進行深入討論；成骨分化相關因子較多，本研究納入較局限。筆者將在以后的研究中，增加實驗類型與難度，進一步探討TGF-β1下游因子在CAVD進展中的作用，納入更多成骨分化相關因子，以證實該結論。

綜上所述，本研究通過轉染miR-486模擬物及抑制物，參照各對照組，分析其對VICs細胞成骨分化的影響及可能的作用機制，證實miR-486的靶基因可能為TGF-β1，其可促進VICs細胞成骨分化。