尿血管緊張素原與腎臟間質炎性細胞浸潤的相關性研究

竇艷娜 ，宋冬巖 ，王春燕 ，劉棟 *，程根陽 ，肖靜 ，趙占正

腎間質纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的最終共同通道，是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后的重要指標，其與腎功能的相關性較腎小球損傷程度與腎功能的相關性更為密切［1-2］。炎性細胞浸潤（包括淋巴細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞）的發生先于腎臟纖維化，是組織纖維化的啟動者［3］，且炎性細胞浸潤與纖維化程度之間有很強的相關性［4］。尿血管緊張素原（uAGT）是一種糖基化球蛋白，主要來源于近端腎小管［5］，與血循環中血管緊張素原（AGT）無關［6-7］。既往研究表明uAGT可作為腎素-血管緊張素系統（RAS）活性的無創評價指標［8-9］，LAI等［10］通過原位雜交的方法發現在IgA腎病中間質炎性細胞浸潤是繼發于RAS的激活。但關于uAGT與腎臟間質炎性細胞浸潤的相關性分析報道較少。本研究旨在檢測uAGT在腎衰竭患者中的表達，分析其與腎臟間質炎性細胞浸潤的相關性。

1 對象與方法

1.1 納入、排除標準 納入標準：年齡≥18歲；血清肌酐≥115 μmol/L（血清酶法，參考范圍20～115 μmol/L）或估算腎小球濾過率（eGFR）＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1（eGFR采用CKD-EPI公式計算［11］）。排除標準：腎前性、腎后性腎衰竭；未簽署知情同意書；腎活檢標本＜10個腎小球者；2個月內服用血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）和/或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）者；腎臟病理表現為亞急性腎小管間質性腎病，或合并亞急性腎小管間質性病理表現者。

1.2 研究對象 依據上述標準選擇2014年12月—2016年4月在鄭州大學第一附屬醫院腎內科住院并行腎活檢的患者77例（腎衰竭組）。選擇同時期本院體檢健康者12例作為對照組。研究對象均簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料 收集腎衰竭組（腎活檢穿刺術前）和對照組的臨床資料，包括性別、年齡、血紅蛋白（Hb）、清蛋白（Alb）、尿素、尿酸、血肌酐、eGFR、尿蛋白定量（以24 h尿總蛋白定量測定為主，未測定的以晨尿中的尿蛋白肌酐比值代替）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）。

1.3.2 病理資料 腎衰竭組患者入院后均行腎活檢穿刺術（對照組未行腎活檢穿刺術），取出的腎組織分為3部分，按常規方法分別進行光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。球性硬化、間質炎性細胞浸潤、間質纖維化、小管萎縮的半定量積分依據Katafuchi評分標準［12］，由至少2名腎臟病理醫師評定。球性硬化積分范圍0～4分，評分標準：0分表示腎小球無病變；l分表示病變腎小球＜10%；2分表示病變腎小球為10%～25%；3分表示病變腎小球＞25%～50%；4分表示病變腎小球＞50%。小管間質病變積分范圍0～9分，包括間質炎性細胞浸潤積分（0～3分）、間質纖維化積分（0～3分）和小管萎縮積分（0～3分），評分標準：0分表示無病變，1分表示病變占皮質腎組織面積＜25%，2分表示病變占皮質腎組織面積為25%～50%，3分表示病變占皮質腎組織面積＞50%。

根據腎臟病理特征分為球性硬化（0分為無球性硬化，1～4分為有球性硬化）、間質炎性細胞浸潤（0～1分為無～輕度，2～3分為中～重度）、間質纖維化（0～1分為無～輕度，2～3分為中～重度）、小管萎縮（0～1分為無～輕度，2～3分為中～重度）。

1.3.3 標本采集 腎活檢當天取新鮮晨尿10 ml，冰水浴冷卻，4 ℃1 000 r/min離心15 min（離心半徑22.5 cm）取上清液，分裝后于-80 ℃冰箱保存，試驗前再次1 000 r/min離心15 min（離心半徑22.5 cm），用于檢測uAGT及尿肌酐。

1.3.3.1 uAGT檢測 采用人總AGT ELISA試劑盒（ 日 本 Immuno-Biological Laboratories Co.，Ltd.Code No. 27412）測定uAGT。尿液按1∶32的比例稀釋，洗滌液、酶標抗體、標準品等按照說明書準備，上樣（每孔100μl），37 ℃孵育60 min。洗滌4次（每孔350 μl），每孔（除試劑空白孔）加100 μl酶聯抗體，37 ℃孵育30 min。洗滌5次（每孔350 μl），每孔加100 μl顯色劑，室溫避光孵育30 min后，每孔加100 μl終止液。酶標儀450 nm波長處讀取各孔的吸光度（A），繪制濃度標準曲線，計算uAGT含量。

1.3.3.2 尿肌酐檢測 采用肌酐測定試劑盒（肌氨酸氧化酶法）檢測尿肌酐水平。試驗條件（提供各類儀器的上機參數）：主/副波長546 nm/660 nm，反應溫度37 ℃，樣本/R1/R2：6/225/75，反應方向：上升（+），反應類型：終點法/2點終點法，校正類型：線性。操作步驟（雙試劑操作）：標本6 μl，R1 225 μl，混勻，37 ℃孵育3～5 min，讀吸光度A1，后加入R2 75 μl混勻，37 ℃孵育5 min，在測定波長下，讀吸光度A2，計算ΔA（ΔA=A2-A1），肌酐（μmol/L）=樣品ΔA/校準品ΔA×校準品濃度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）〔M（QR）〕表示，兩組間比較采用非參數檢驗；計數資料以相對數表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析；繪制uAGT診斷腎臟病理損傷的受試者工作特征（ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 兩組臨床資料及uAGT比較Table 1 Comparison of clinical data and uAGT between all patients and healthy subjects

表2 腎衰竭患者uAGT與臨床資料的相關性分析Table 2 Correlation between uAGT and clinical parameters in patients with renal failure

表3 腎衰竭患者uAGT與病理資料的相關性分析Table 3 Pearson or Spearman correlation between uAGT and pathological lesions in patients with renal failure

2 結果

2.1 基本資料 腎衰竭組男51例、女26例，年齡20～76歲。IgA腎病22例，急性腎小管損傷14例，微小病變9例，糖尿病腎病6例，新月體性腎小球腎炎5例，膜性腎病4例，急性腎小管間質性腎病4例，局灶節段硬化性腎炎3例，缺血性腎損傷3例，管型腎病2例，原發病為輕微病變1例，局灶增生性腎小球腎炎1例，膜增生性腎小球腎炎1例，血栓性微血管病腎損害1例，慢性腎小管間質性腎病1例。對照組男6例、女6例，年齡27～61歲。

2.2 臨床資料與uAGT比較 腎衰竭組和對照組的性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。腎衰竭組Hb、Alb、eGFR、HDL低于對照組，尿素、尿酸、血肌酐、TC、TG、uAGT高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 腎衰竭患者uAGT與臨床、病理資料的相關性分析腎衰竭患者uAGT與Hb、Alb、尿酸、eGFR呈負相關，與尿蛋白定量呈正相關（P＜0.05，見表2）。uAGT與球性硬化、間質炎性細胞浸潤、間質纖維化、小管萎縮積分呈正相關（P＜0.05，見表3）。

2.4 不同病理特征腎衰竭患者部分臨床資料比較 有球性硬化患者尿蛋白定量高于無球性硬化患者，中～重度間質炎性細胞浸潤患者血肌酐、uAGT高于無～輕度間質炎性細胞浸潤患者，中～重度間質炎性細胞浸潤患者eGFR低于無～輕度間質炎性細胞浸潤患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

2.5 uAGT的診斷價值 uAGT診斷球性硬化、間質炎性細胞浸潤、間質纖維化、小管萎縮的AUC分別為0.627（P=0.056）、0.689（P=0.005）、0.627（P=0.06）、0.639（P=0.043）（見圖1～4）。

表4 不同病理特征腎衰竭患者部分臨床資料比較Table 4 Comparison of partial clinical data of renal failure patients with different pathological characteristics

圖1 uAGT診斷球性硬化的ROC曲線Figure 1 The ROC curve of uAGT in the diagnosis of glomerular sclerosis

圖2 uAGT診斷間質炎性細胞浸潤的ROC曲線Figure 2 The ROC curve of uAGT in the diagnosis of interstitial inflammatory cell infiltration

3 討論

腎間質纖維化幾乎是所有進展性慢性腎臟病的最終結局，同時也是較好的預后預測因子和腎衰竭的主要決定性因素。有研究表明，炎性細胞浸潤是組織纖維化的啟動者，且炎性細胞浸潤與纖維化程度之間有很強的相關性［3-4］。判斷小管間質損傷程度的金標準為腎活檢，由于其具有禁忌證和創傷性，無法作為常規、動態的檢測手段，故對與間質炎性細胞浸潤密切相關的無創生物學標志物的探索具有很大價值。

近年來人類AGT ELISA系統已經建立［13-14］，通過該方法發現，在高血壓［15］、糖尿病腎病［16-17］、IgA腎病［18-19］、膜性腎病［20］、慢性腎臟病［21-22］患者中，uAGT的表達可以反映腎內RAS系統的活性。本研究采用ELISA檢測腎衰竭患者uAGT，發現uAGT在腎衰竭患者中的表達高于對照組，提示uAGT可以用來反映腎損傷的程度。相關性分析發現，uAGT與eGFR呈負相關，與文獻結果相似［21］。提示uAGT升高可能是反映腎損傷嚴重程度的指標［21-24］。本研究中，uAGT與尿蛋白定量呈正相關，與部分文獻結果相似［9］，但與動物研究結果不同［25］。其原因可能與RAS的物種差異有關，此外，動物研究大多以各種高血壓大鼠模型為主，影響因素相對單一，而本研究對象為腎衰竭患者，影響因素較復雜，故兩者關系在人類、動物間的差異還值得進一步研究。另外，uAGT不是蛋白尿的非特異性產物，KOBORI等［25］在醋酸脫氧皮質酮和高鹽飲食誘導的高血壓大鼠中進行了研究，發現uAGT與蛋白尿不具一致性。

本研究發現uAGT與球性硬化、間質炎性細胞浸潤、間質纖維化、小管萎縮之間均具有相關性，其中與間質炎性細胞浸潤的相關性最強。同時本研究還顯示，不同間質炎性細胞浸潤、小管萎縮程度患者的uAGT有明顯差異。本研究結果顯示，uAGT對間質炎性細胞浸潤的診斷價值較高，這在既往研究中未見類似報道。

圖3 uAGT診斷間質纖維化的ROC曲線Figure 3 The ROC curve of uAGT in the diagnosis of interstitial fibrosis

圖4 uAGT診斷小管萎縮的ROC曲線Figure 4 The ROC curve of uAGT in the diagnosis of tubular atrophy

uAGT主要來源于近端腎小管［5］，與血循環AGT無關［6-7］，其為RAS限速酶-腎素的唯一底物，最終產生RAS的主要效應分子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）。uAGT能較好地反映腎臟局部AngⅡ活性，可作為腎內RAS活性的無創評價指標［7，19］。近年來已有證據表明腎臟局部存在獨立的RAS，并且其與循環RAS無明顯相關性。腎臟局部RAS的活化在腎損傷發生發展中起重要作用。實驗證實靶器官局部的AngⅡ通過誘導非感染炎癥作用導致靶器官損傷。AngⅡ是一種前炎性細胞因子和趨化因子，能夠激活一系列炎性因子的表達［26］，其中單核細胞趨化因子-1（MCP-1）被認為是Ang Ⅱ誘導的炎性反應中最重要的趨化因子之一［27］，且有研究證實MCP-1與藥物介導的小管間質性腎炎患者間質炎性細胞浸潤有很強的相關性［28］。LAI等［10］通過原位雜交的方法發現在IgA腎病中間質炎性細胞浸潤是繼發于RAS激活后的現象。而本研究證實了uAGT與間質炎性細胞浸潤具有很強的相關性。

同時，本研究也有一定的局限性：（1）本研究中僅采用ELISA從蛋白水平對uAGT的表達進行了分析，有靈敏度低和易受主觀因素影響的缺點；（2）uAGT易受高血壓、糖皮質激素、高血糖等因素影響，本研究中部分研究對象伴有高血壓、高血糖、曾經使用過糖皮質激素，可能對檢測結果有一定影響。（3）既往有研究表明，藥物介導的小管間質性腎炎患者中，在對間質炎性細胞浸潤的準確性評價方面，MCP-1對其診斷的準確性最高［28］，而本研究中沒有檢測MCP-1，也未對二者進行對比。故接下來應考慮從基因水平對uAGT的表達進行評價，從而更有力地闡明uAGT與臨床、病理指標間的關系，同時應檢測MCP-1等生物標志物，以尋求對腎臟病理損傷評價準確性最高的標志物，必要時也可以進行多種標志物的聯合診斷。

綜上所述，uAGT在腎衰竭患者中顯著升高，且與eGFR呈負相關，可反映腎功能受損的嚴重程度。uAGT與間質炎性細胞浸潤的相關性最強，同時可以反映間質炎性細胞浸潤的嚴重程度，可作為間質炎性細胞浸潤的無創評價指標。

作者貢獻：竇艷娜進行文章的構思與設計；宋冬巖進行研究的實施與可行性分析、數據收集、數據整理、統計學處理，并撰寫論文；竇艷娜、宋冬巖、王春燕、劉棟、程根陽、肖靜、趙占正進行結果的分析與解釋；竇艷娜進行論文及英文的修訂；劉棟負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。