異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜的抑制作用觀察

劉雪萍，林浩琪，沈志濱，莊素琪，王麗丹，唐春萍,2，江濤,2

(1廣東藥科大學，廣州 510006;2廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心)

以紅色毛癬菌為代表的皮膚癬菌為臨床常見致病真菌[1,2]。據估計，全球有20%～25%的人感染皮膚癬菌[3]。目前，抗真菌藥物面臨日益惡化的耐藥問題，生物被膜的形成是其耐藥的重要原因之一[4]。研究[5～7]發現，白色念珠菌和紅色毛癬菌形成生物被膜后對藥物敏感性增加2 000倍以上。目前對皮膚癬菌生物被膜及相關抑菌藥物的研究較少，現亟需開發新的藥物對抗皮膚癬菌的耐藥問題。香鱗毛蕨，在民間被廣泛用于治療皮膚病。香鱗毛蕨中的間苯三酚類化合物是該屬植物主要成分，也是其產生抗皮膚癬菌作用的主要成分[8, 9]。前期初步研究發現，香鱗毛蕨中異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌CMCC(F)T1b及石膏樣小孢子菌CMCC(F)M2c具有良好的抗癬菌效果[10]。2017年9月～2018年1月，本實驗觀察了異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜的抑制作用，并從生物被膜形態變化、麥角甾醇的生物合成通路研究其可能作用機制，為其進一步的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 香鱗毛蕨采購自黑龍江省，由哈爾濱商業大學藥學院張德連教授鑒定，批號：XLMJ-20171007；異黃綿馬酸PB為實驗室自制，于香鱗毛蕨中提取分離而得，經高效液相色譜法測定，純度>98%；鹽酸特比萘芬(TBF)購自大連美侖生物技術有限公司，批號M0726A；兩性霉素B(AMB，AMRESCO，批號A0414)。

1.1.2 菌種 紅色毛癬菌標準株CMCC(F)T1a、CMCC(F)T1d，臨床菌PYA1、PYA2，近平滑念珠菌ATCC-22019，均購于中國醫學科學院皮膚病研究所(南京)。

1.1.3 試劑 XTT鈉鹽購自SIGMA-ALDRICH公司，批號SLBS3414V；TRIzol(9109)購自TaKaRa公司；BestarTMqPCR RT kit(2220)購自DBI公司；BestarTMqPCR MasterMix(2043)購自DBI公司；DEPC(6079)購自Macklin公司。

1.1.4 儀器 iMark酶標儀(美國BIO-RAD公司)；E-1010離子濺射儀(日本株式會社日立高新科技那珂事業所)；S-3400N掃描電鏡(日本株式會社日立高新科技那珂事業所)；Waters Acquity Uplctm H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；超微量紫外分析儀(Q6000UV)(Quawell Technology)；紫外透射分析儀(ZF1-Ⅱ)(上海嘉鵬科技有限公司)；核酸電泳儀(DYY-2C)(北京六一儀器)；ABI real-time PCR儀(7500)(ABI公司)；Stratagene real-time PCR儀(Mx3000P)(Agilent公司)；PCR擴增儀(K960)(杭州晶格科學儀器有限公司)。

1.2 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MFC)的測定 按M38-A2中微量稀釋法[11]，分別取培養好的各工作菌配制菌懸液，血細胞計數板計數；將異黃綿馬酸PB、AMB、TBF溶于DMSO中分別制成32、6.4、0.2 mg/mL的儲備液，用RPMI1640培養基稀釋50倍至2倍終濃度。在96孔板中分別加入藥液和菌液，使菌液終濃度為1×103～3×103CFU/mL，第1～11孔異黃綿馬酸PB終濃度依次為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 μg/mL，AMB終濃度依次為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL，TBF終濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 8、0.003 9、0 μg/mL，即第11、12孔分別為含菌不含藥正常對照、僅含培養基空白對照，于35 ℃培養箱中培養96 h，肉眼觀察以真菌被100%抑制的最低藥物濃度為MIC。以近平滑念珠菌ATCC-22019為質控菌，AMB為質控藥，第48 h觀察，質控結果MIC在0.5～4.0 μg/mL為合格。從不長菌的孔中每孔取100 μL至含PDA培養基的培養皿上繼續培養7～10天，以不長菌的最低藥物濃度為MFC。當MIC及MFC能準確重復或只差1個濃度梯度時結果可被接受，否則需重測。以上實驗重復3次，取平均值。異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌的MIC、MFC范圍分別在20～40、20～80 μg/mL；AMB對紅色毛癬菌的MIC、MFC范圍分別為0.5、0.5～1 μg/mL，TBF對紅色毛癬菌的MIC、MFC范圍分別為0.007 8～0.125 0、0.015 6～0.125 0 μg/mL。結果見表1。AMB對近平滑念珠菌ATCC-22019的MIC為1 μg/mL，在M38-A2標準中規定的0.5～4.0 μg/mL范圍內，質量控制合格，提示測試結果可信。

表1 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌的MIC、MFC

1.3 紅色毛癬菌生物被膜體外模型建立及異黃綿馬酸PB對生物被膜最低抑菌濃度(sMIC)測定

1.3.1 生物被膜的建立 用含10%胎牛血清的RPMI1640液體培養基(FR)分別將紅色毛癬菌CMCC(F)T1d、PYA1菌懸液稀釋成1×106CFU/mL，接種到96孔板1～11列，每孔200 μL，35 ℃溫箱中培養6 h，用PBS緩沖液洗去游離菌，加入FR繼續培養到96 h至生物被膜成熟。

1.3.2 sMIC50、sMIC80測算 參照微量稀釋法并微作調整，在空白96孔板上倍比稀釋藥物，使1～10列濃度分別為250.00～0.49 μg/mL。各菌株生物被膜成熟后，棄去培養基，加入稀釋好的藥物，繼續培養48 h，加入XTT反應2 h，用酶標儀測定OD490值。與生長對照孔比，抑制50%及80%被膜生長的藥物濃度即sMIC50、sMIC80。當sMIC50、sMIC80值能準確重復或只差1個濃度梯度時結果可被接受。實驗重復3次，取平均值。

1.4 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜超微結構的影響觀察 采用掃描電鏡法。根據“1.3.1”在放有玻璃細胞爬片的6孔板中建立紅色毛癬菌CMCC(F)T1d成熟生物被膜，棄去培養基。將生物被膜分為正常組和藥物組(異黃綿馬酸PB組、AMB組、TBF組)共4組，用FR培養基將異黃綿馬酸PB、AMB、TBF分別稀釋為125、2、125 μg/mL，分別加入各組成熟生物被膜孔，35 ℃繼續培養48 h，用PBS洗去藥物及培養基，按文獻[6]固定、脫水、鍍金，通過掃描電鏡觀察紅色毛癬菌生物被膜的形態。

1.5 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜中麥角甾醇含量的影響觀察

1.5.1 紅色毛癬菌生物被膜前處理 根據“1.4”分組制備含藥不含爬片生物被膜反應體系，48 h后將生物被膜轉移至無菌EP管中。用無菌水沖洗，離心，去掉上清液，濾紙吸去水分。將各組菌團分別轉移至10 mL EP中，稱量濕菌重，分別加入3 mL新配制的25%氫氧化鉀甲醇溶液，80 ℃水浴，冷卻后加入2 mL去離子水及3 mL石油醚萃取3次。取醚層于80 ℃水浴揮去石油醚，用甲醇溶解并定容至2 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾后低溫密閉保存。

1.5.2 紅色毛癬菌生物被膜中麥角甾醇含量測定 采用超高效液相色譜法(UPLC)。參考文獻[12]并稍作調整進行系統適應性測定，色譜柱：Venusil MP C18(2.1×100 mm，2.5 μm)；流動相：100%甲醇溶液；流速：0.50 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：281 nm。各實驗組取平行制備而得的3份供試品溶液測定峰面積。樣品主峰和其他雜質峰分離度大于1.5，以麥角甾醇濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線得回歸方程y=6 287x-361.06，r=0.999 7。結果表明，麥角甾醇對照品在4～40 μg/mL范圍內線性關系良好；精密度良好，RSD=1.43%。穩定性試驗中供試品溶液在24 h內穩定，回收率達99.21%，RSD值為1.37%，回收率良好。由標準曲線可知，生物被膜中麥角甾醇含量與麥角甾醇下降率計算公式如下：生物被膜中麥角甾醇含量(μg/g)=[(峰面積+361.06)×稀釋倍數×進樣量]/(6 287×濕菌重)；麥角甾醇下降率(%)=(正常組生物被膜中麥角甾醇含量-藥物組生物被膜中麥角甾醇含量)/正常組生物被膜中麥角甾醇含量×100%。

1.6 紅色毛癬菌生物被膜中ERG1、MEP4 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。設置正常組、異黃綿馬酸PB組及TBF組3個藥物組，根據“1.4”制備含藥不含爬片生物被膜反應體系，24 h后用冷PBS清洗，離心后將生物被膜轉移至凍存管中，液氮中保存。取適量菌樣，加入1 mL的TRIzol研磨，加入氯仿，震蕩后離心，取上層水相加入異丙醇，混勻后離心去上清；用75% DEPC乙醇洗滌，離心棄去液體；室溫晾干，加入DEPC處理過的ddH2O水，溶解RNA，濃度測定后于-80 ℃凍存備用。以4 μg總RNA為模板，按照Bestar qPCR RT Kit說明書配制逆轉錄反應體系，總體系為10 μL，合成cDNA第一鏈(普通逆轉體系配制)。合成β-tubulin(內參)、ERG1及MEP4引物，引物序列(5′-3′)β-tubulin F為GCATCTTTTGTTGGCACCGT，β-tubulin R為TACCGGGCTTCAAATGTCCC；ERG1 F為GTGAAGATACCTTTCCCTAGCG，ERG1 R為TTATGGTAGAAACGGCCTTGG；MEP4 F為GCATGGACTTATGCTTGCGG，MEP4 R為TGGATATCTGGGGAAGGCGA。分別加入BestarTMSybrGreen qPCR MasterMix 10 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL、cDNA模板1 μL 、ddH2O 8 μL，形成20 μL的real-time PCR擴增反應體系。反應條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。溶解曲線分析：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s。用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行熒光定量PCR實驗。以上操作重復3次，取平均值。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜的抑制作用 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜sMIC80范圍在62.50～125.00 μg/mL，AMB對生物被膜抑制作用下降，TBF對生物被膜的sMIC50、sMIC80均≥250.00 μg/mL，出現嚴重的耐藥現象。結果見表2。

表2 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜的

2.2 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜超微結構的影響 掃描電鏡觀察發現正常組的紅色毛癬菌生物被膜生長良好，菌絲充盈且粗細均勻，呈圓柱狀，分生孢子形態飽滿，菌絲表面有細胞外基質密布，菌絲間有大量呈黏連狀的細胞外基質附著。與正常組相比，藥物組成熟生物被膜均受到了一定程度的破壞。異黃綿馬酸PB組生物被膜生長明顯受到抑制，菌絲呈扁平狀且出現大量斷裂，未見分生孢子，僅有少量干癟狀細胞外基質。AMB組生物被膜緊貼爬片表面，菌絲表面凹凸不平，菌絲多處斷裂，細胞外基質皺縮緊貼于菌絲表面。TBF組生物被膜生長被減弱，菌絲干癟、粗細不均，無孢子，少見細胞外基質。電鏡掃描結果見圖1。

2.3 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜中麥角甾醇含量的影響 正常組、異黃綿馬酸PB組、AMB組、TBF組紅色毛癬菌生物被膜中麥角甾醇含量分別為(3.68±0.05)、(2.36±0.01)、(1.72±0.02)、(2.67±0.01)μg/g，后三組與正常組比較P均<0.01。

注：a為正常組；b為異黃綿馬酸PB組；c為AMB組；d為TBF組。

圖1掃描電鏡下紅色毛癬菌生物被膜的超微結構

與正常組相比，異黃綿馬酸PB組、AMB組、TBF組對紅色毛癬菌生物被膜中麥角甾醇下降百分率分別為35.87%、53.30%、27.40%。

2.4 異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜中ERG1、MEP4 mRNA表達的影響 正常組、異黃綿馬酸PB組、TBF組ERG1 mRNA相對表達量分別為1.36±0.03、1.00±0.06、0.41±0.02，MEP4 mRNA相對表達量分別為2.86±0.08、1.00±0.08、1.32±0.02，異黃綿馬酸PB組、TBF組與正常組相比P均<0.01。

3 討論

皮膚癬菌為臨床常見致病菌。由皮膚癬菌導致的慢性感染中90%由紅色毛癬菌引起[13]。癬菌病存在于淺表皮膚、指甲，且常見于免疫缺陷者[14]及老年患者體內[15]，治療周期長且反復難愈。現有抗菌藥物的不合理使用等導致真菌的耐藥性增加。在近幾年真菌耐藥性研究中發現，真菌不只是以浮游菌的狀態存在，真菌黏附于載體表面后，以群體形式通過菌絲間相互交錯傳達信息，釋放大量細胞外基質及新生孢子，層層疊加，不斷形成更復雜的種群或群落即生物被膜[4]。生物被膜的形成可能是真菌產生耐藥性并增加傳染性的原因之一，生物被膜高度群體化幾乎能對抗所有的抗真菌藥物，使藥物最低抑菌濃度增加幾十倍[16]甚至上萬倍[17]。近期研究發現，紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和犬小孢子菌也可形成生物被膜[6, 7]，紅色毛癬菌及犬小孢子菌形成生物被膜對抗菌藥物TBF耐藥性增大千倍以上[6]。針對皮膚癬菌的耐藥問題，新藥物的開發是重要解決策略。

本實驗研究結果顯示異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌游離菌的MIC范圍是20～40 μg/mL，MFC范圍是20～80 μg/mL，抗菌作用較強。因生物被膜和浮游菌生長狀態不同，需對微量稀釋法做出調整以測定藥物對生物被膜的作用，XTT染色法可通過對藥物孔與生長對照孔吸光度值的比較，檢測紅色毛癬菌生物被膜的代謝活性[7]。將藥物對紅色毛癬菌浮游菌MIC及對sMIC80比較，陽性藥AMB對生物被膜抑菌濃度最大增加7.81倍，TBF對生物被膜抑菌濃度增加上千倍，說明TBF雖然對浮游菌抑菌效果最強，但生物被膜卻對其產生嚴重的耐藥現象；而異黃綿馬酸PB對生物被膜抑菌濃度最大增加6.25倍，呈現出較好的抗生物被膜作用。

掃描電鏡檢測發現，相對于正常組紅色毛癬菌生物被膜，各藥物組生物被膜均受到明顯抑制，異黃綿馬酸PB組菌絲被抑制，變細變癟且韌性降低，出現斷裂，少見細胞外基質，AMB組三維結構變薄，菌絲不再規則失去條形結構，TBF組菌絲變扁平，無細胞外基質。藥物發揮抗紅色毛癬菌生物被膜作用時，會抑制生物被膜表面細胞外基質的產生，并可能通過滲透到菌絲中使其中物質泄漏或直接抑制菌絲的正常生長而使菌絲呈現干癟狀[16]。

現有的抗皮膚癬菌藥多通過減少菌體中麥角甾醇發揮抗菌作用，AMB通過直接與麥角甾醇結合，TBF通過抑制角鯊烯環氧化酶，最終均使麥角甾醇含量降低。麥角甾醇含量的測定多用UPLC。Komoto等[18]用UPLC測定了紅色毛癬菌浮游菌中麥角甾醇的含量。UPLC具有出峰時間短、靈敏度高等優點。本實驗借助該方法發現，異黃綿馬酸PB作用后生物被膜中麥角甾醇含量顯著降低，說明其抗紅色毛癬菌生物被膜作用可能是通過抑制癬菌被膜中麥角甾醇的合成，使生物被膜缺乏營養成分及結構形成的必須元素從而抑制被膜生長。

ERG1是角鯊烯環氧化酶形成的必需基因，而角鯊烯環氧化酶是麥角甾醇合成通路中重要的轉化酶之一。以TBF為代表的烯丙胺類抗真菌藥，可通過抑制鯊烯環氧化酶，并使鯊烯在細胞中蓄積而發揮殺菌作用。本實驗結果發現，異黃綿馬酸PB及陽性藥TBF均抑制了ERG1，說明ERG1可能是異黃綿馬酸PB的靶點基因。此外，生物被膜的形成加大了紅色毛癬菌的侵襲力，其中MEP作為角蛋白酶的主要組成部分,被認為是皮膚癬菌入侵機體過程中的重要毒力因子和營養因子，以MEP4為代表的基因參與了該酶的合成[19]。本實驗發現異黃綿馬酸PB及TBF均能顯著抑制MEP4的表達，說明MEP4可能也是其作用靶基因之一。sMIC結果顯示紅色毛癬菌生物被膜對TBF產生了耐藥，而ERG1和MEP4 mRNA水平都下降且有統計學差異，說明將藥物濃度增加1 000倍后，TBF仍可發揮一定的抑菌效果。

綜上，異黃綿馬酸PB對紅色毛癬菌生物被膜具有較好的抑制效果，明顯破壞生物被膜正常形態，并可通過抑制紅色毛癬菌生物被膜中基因ERG1抑制麥角甾醇合成、抑制致毒基因MEP4發揮抗菌作用。本實驗僅測定了異黃綿馬酸PB對4株紅色毛癬菌的浮游菌及2株紅色毛癬菌的生物被膜的抗菌作用，因菌株之間對藥物敏感性的差異，在后續實驗中，需擴大菌株數量進一步確認其抗菌譜。生物被膜的耐藥涉及到其麥角甾醇合成通路中復雜的酶促反應及基因調控[4]，在本研究結果的基礎上，仍需深入探討異黃綿馬酸PB抑制紅色毛癬菌生物被膜的作用機制。