GC-MS/MS法測定玉葉金花中22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留

廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021

玉葉金花來源于茜草科玉葉金花屬植物玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.) 的干燥莖和根，又名白紙扇、野白紙扇、山甘草、土甘草、涼口茶、仙甘藤等，分布于湖北、廣東、廣西、四川、貴州和云南等地，具有清熱利濕、解毒消腫之功效。主治感冒、中暑發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛、泄瀉、痢疾、腎炎水腫、濕小便不利、瘡瘍膿腫、毒蛇咬傷[1-2]。民間常用玉金花根研粉拌粥服治療小兒疳積，或全株水煎當(dāng)飲治療精神分裂癥，也有作抗生育藥用，以及治療斷腸草、木薯、野菌中毒[3-4]。

有機(jī)氯類農(nóng)藥大部分品種已經(jīng)被全面禁止生產(chǎn)和使用，但由于其曾被世界各國廣泛使用，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，至今土壤[5]、水體[6]、中藥材[7～9]中仍有檢出。2015 版《中國藥典》收錄了22種有機(jī)氯類的氣相色譜測定方法，該方法根據(jù)待測農(nóng)藥的保留時(shí)間進(jìn)行定性，易受基質(zhì)干擾，且易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。2015 版《中國藥典》同時(shí)收錄了農(nóng)藥多殘留量的GC-MS/MS及LC-MS/MS測定方法，但該方法定量需要使用通常情況下難以獲得的空白基質(zhì)[10]。本研究以2015 版《中國藥典》為基礎(chǔ)，建立QuECHERS (Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法結(jié)合Florisil固相萃取小柱凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉葉金花中22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的分析方法，并從野外采集22批玉葉金花樣品，對22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量進(jìn)行測定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與材料 安捷倫7000C GC-MS/MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，AE200分析天平，TALBOYS數(shù)顯型多管式渦旋混合器，半自動(dòng)固相萃取裝置( Dikma公司)。有機(jī)氯農(nóng)藥混合溶液(批號：61005-201501，中國食品藥品檢定研究院)；氘代莠去津(內(nèi)標(biāo)，批號：50331，Dr. Ehrenstorfer GmbH)。實(shí)驗(yàn)用22批玉葉金花樣品由野外采集，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所黃清泉藥師鑒定，乙腈為色譜純。弗羅里硅土固相萃取小柱(1000 mg/6 mL，沃特世公司)。

1.2 溶液的制備

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

1.2.1.1 內(nèi)標(biāo)貯備溶液的制備 取氘代莠去津適量10.11 mg，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL各含 1000 μg 的溶液。

1.2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取內(nèi)標(biāo)貯備溶液適量0.6 mL，置100 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，即得每1 mL含 6 μg的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

1.2.2.1 對照品儲(chǔ)備液制備 精密量取機(jī)氯農(nóng)藥混合對照品溶液(10 μg/mL)1.00 mL，置20 mL量瓶中，加異辛烷至刻度，作為對照品儲(chǔ)備液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 精密量取對照品儲(chǔ)備液(約0.5 μg/mL)2.00 mL、2.00 mL，分別置5 mL、10 mL量瓶中，加異辛烷稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線1、2。精密量取標(biāo)準(zhǔn)曲線2試液5.00、1.00、1.00、1.00 mL，分別置10 mL、5 mL、10 mL、20 mL量瓶中，加異辛烷稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線3～6。

1.2.3 供試品溶液的制備 取供試品，粉碎成粉末(過四號篩)，取約3 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL與內(nèi)標(biāo)溶液 150 μL，渦旋使混勻，置渦旋混合儀上渦旋混合(2000次/ min)5 min，于冰浴中冷卻10分鐘，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末(4∶1)7.5 g，立即搖散，再置渦旋混合器上渦旋混合(2000 次/ min)3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心(9000轉(zhuǎn)/ min) 5 min，取上清液9 mL, 置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺(PSA)300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠 300 mg ,石墨化炭黑90 mg]中，渦旋使充分混勻，再置渦旋混合器上渦旋混合(2000次/min ) 5 min使凈化完全，離心(4000轉(zhuǎn)/ min) 5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40 ℃水浴濃縮至近干，加少量正己烷替換2次，加正己烷1 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至弗羅里硅土固相萃取小柱[1000 mg/6 mL, 用正己烷-丙酮(95∶5)混合溶液10 mL和正己烷10 mL預(yù)洗]上，殘?jiān)谜和橄礈?次，每次 1 mL，洗液轉(zhuǎn)移至同一弗羅里硅土固相萃取小柱上，再用正己烷-丙酮(95∶5)混合溶液10 mL洗脫，收集全部洗脫液，置氮吹儀上吹至近干，加異辛烷定容至1 mL，渦旋使溶解，即得。

1.3 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定

1.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：VF-1701氣相毛細(xì)管色譜柱(柱長30 m，內(nèi)徑 0.25 mm，膜厚0.25 μm)，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，流速：0.8 mL/min，脈沖不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，程序升溫，初始溫度60 ℃，保持0.5 min，以每分鐘60 ℃的速率升溫至170 ℃，再以每分鐘5 ℃的速率升溫至220 ℃，保持5 min，再以每分鐘1 ℃的速率升溫至240 ℃，再以每分鐘15℃的速率升溫至280 ℃，保持5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 EI 源，電子轟擊能量為70 eV，倍增電壓為1.3 kV， 四級桿溫度150 ℃，離子源溫度為230 ℃，色譜-質(zhì)譜接口溫度280℃，溶劑延遲時(shí)間0.5 min，數(shù)據(jù)采集模式MRM，22種農(nóng)藥成分及內(nèi)標(biāo)氘代莠去津的保留時(shí)間及MRM參數(shù)見表1。

表1 22 種農(nóng)藥化合物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間及質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線1～6混合對照品溶液各1.00 mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，混勻，在所確定的色譜條件下進(jìn)行測定，分別對22種農(nóng)藥成分的峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測農(nóng)藥質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明， 待測農(nóng)藥檢測質(zhì)量濃度線性范圍為5～200 ng/mL(r大于0.999)。

2.2 精密度試驗(yàn) 取濃度約100 μg/L的混合對照品液，連續(xù)進(jìn)樣6 次， 測定各農(nóng)藥組分的峰面積，結(jié)果各農(nóng)藥組分RSD均小于5% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取不含農(nóng)藥的玉葉金花樣品9份，精密加入濃度約100 μg/L的混合對照品液3.00 mL、1.50 mL、0.30 mL(加樣水平0.10、0.05、0.01 mg/kg，各3份)，低溫?fù)]干溶劑，按供試品溶液制備方法，同法制成加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液，測定，計(jì)算各加樣水平下平均回收率及RSD，測定結(jié)果和檢出限見表2。

表2 回收率和檢出限試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

表2 回收率和檢出限試驗(yàn)結(jié)果

2.4 檢出限測定 參考各農(nóng)藥組分在《中國藥典》2015年版第四部農(nóng)藥殘留測定法第四法“氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”的檢出限參考值，做檢出限水平的加樣回收試驗(yàn)(詳見表2)，結(jié)果各農(nóng)藥組分檢出限水平的加樣樣品定性、定量離子信噪比均大于3。低于檢出限以未檢出計(jì)。

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)的選擇 實(shí)驗(yàn)中測定的玉葉金花樣品均為我所野外采集，沒有種植的樣本，故主要考察殘留期長、高毒性的有機(jī)氯農(nóng)藥。

3.2 提取凈化方法的選擇 中藥基質(zhì)復(fù)雜，農(nóng)藥多殘留測定中，需要選擇適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┰嚻啡芤阂脖仨毥?jīng)過適當(dāng)方法凈化，否則難以獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果。針對玉葉金花中雜質(zhì)干擾情況，本實(shí)驗(yàn)建立了QuECHERS法結(jié)合Florisil固相萃取小柱的凈化方法，效果滿意。用乙腈提取對脂肪和色素的溶解能力最小，且滲透能力強(qiáng)，對農(nóng)藥的提取效率高。QuECHERS法是一種快速、簡便、價(jià)格低廉、實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量提取的農(nóng)藥殘留分析方法。Florisil固相萃取小柱能有效去除極性化合物，對弱極性有機(jī)氯農(nóng)藥有較好的凈化效果，QuECHERS法結(jié)合Florisil固相萃取小柱，能有效去除基質(zhì)干擾，采用內(nèi)標(biāo)法定量，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中除六氯苯偏低外，其余21種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率均在74.5%～129.6%之間，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足《中國藥典》2015年版農(nóng)藥殘留分析的要求。

3.3 定量方法的選擇 《中國藥典》2015年版第四部農(nóng)藥殘留測定法(第四法) 推薦選擇氘代倍硫磷作為GC-MS/MS測定的內(nèi)標(biāo)，使用基質(zhì)混合對照品溶液測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。本實(shí)驗(yàn)在此方法基礎(chǔ)上，增加了Florisil固相萃取小柱凈化，進(jìn)一步去除了基質(zhì)干擾,使用氘代莠去津作為內(nèi)標(biāo)，直接配制混合對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，避免了空白基質(zhì)的使用，簡化了實(shí)驗(yàn)操作。

3.4 樣品測定 依法測定玉葉金花樣品22批，結(jié)果22批樣品22種農(nóng)藥組分均未檢出。表明野外采集的玉葉金花沒有受到有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的污染。

4 結(jié)論

本研究建立了QuECHERS法結(jié)合Florisil固相萃取小柱凈化，內(nèi)標(biāo)法定量，氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉葉金花中22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的分析方法，該方法在5 μg/L～ 200 μg/L范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，回收率和重現(xiàn)性良好，能夠在無需空白基質(zhì)樣品的情況下，準(zhǔn)確地測定玉葉金花中22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量。