南高叢藍莓VcMET1基因分離及在果實發育中的表達分析*

邵 楠， 陳曼曼， 朱雨飛， 陳文榮， 宗 宇，李永強， 廖芳蕾， 郭衛東， 楊 莉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

表觀遺傳是指在植物體發育和細胞增殖過程中，基因序列不發生改變，而基因表達發生可遺傳的改變，主要涉及DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質重塑、基因沉默與RNA編輯等調控機制[1-4].DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組常見的共價修飾形式之一.DNA甲基轉移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基轉移到特定DNA序列的堿基上，主要以5-甲基胞嘧啶(5mC)形式發生于對稱序列CG,CHG(H=A,C或T)，以及非對稱序列CHH[3-5].植物中至少有4種胞嘧啶甲基轉移酶，包括維持DNA甲基轉移酶(methyltransferases，METs)家族、結構域重組甲基化酶(domains rearranged methyltransferases，DRMs)、染色質甲基化酶(chromomethylases，CMTs)與DNA甲基轉移酶2(DNA methyltransferases,Dnmt 2)家族[3,6-7].越來越多的研究表明，DNA甲基化在植物生長發育及應對環境脅迫中發揮重要作用，可影響植物株高、花型、果實著色、抗病性、生育期及其與環境的互作等[2-4,8].

藍莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，多年生落葉或常綠灌木或小灌木[9].藍莓果實因富含花青素、多種人體必需氨基酸及硒等營養成分，被譽為“21世紀功能性保健漿果”.與其他水果相比，藍莓果實單果重輕(約1.0 g)、產量低(畝產約1 000 kg)、不耐貯運，因此,培育或篩選大果型、高產、抗病蟲害、耐貯運且便于機械操作的藍莓果實是果樹育種者的主要目標[10-11].目前國內外對藍莓果實的研究主要集中在品質、貯藏加工、花青苷合成及調控機制等方面[12-17]，鮮有DNA甲基化與藍莓果實發育的相關研究.本實驗以果實較大的藍莓果實品種‘奧尼爾’(O′Neal)與小果品種‘藍雨’(Bluerain)為研究材料，分離DNA甲基化基因MET1 cDNA序列，研究其果實在不同發育時期的表達規律，為進一步探討這些基因在藍莓果實發育進程中的生物學功能與分子調控機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料為定植于浙江師范大學生物園6年生的藍莓(V.corymbosum)‘奧尼爾’與‘藍雨’果實，將鈴鐺花期(去除花瓣，僅保留花托與子房)標記為S0期，取果實生長發育曲線特定時期樣品，每個時期采樣20～50個果實.以‘奧尼爾’為例，果實取樣時狀態參見圖1.S5期及以后的果實取回后，迅速用手術刀切成小塊.處理后的樣品經液氮速凍后，凍存于-80 ℃備用.

圖1 ‘奧尼爾’藍莓果實發育過程中各時期取樣點

1.2 總RNA的提取及cDNA一鏈合成

參照張彥蘋等[18]建立的改良SDS法提取各時期混合樣品總RNA，DNase I去除殘留的基因組DNA.RNA經凝膠電泳及紫外分光光度計法檢測質量與濃度后，取1 μg參照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser(TakaRa)說明書合成cDNA一鏈，保存于-20 ℃備用.

1.3 VcMET1基因cDNA分離及序列分析

根據IGB(integrated genome browser 8.4.4)軟件發布的藍莓序列(VcMET1：cuff.5305.1)設計引物(見表1)，以‘奧尼爾’S1期cDNA為模板，應用PCR法分別分離VcMET1基因編碼區cDNA，連接至T載體后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，每個基因重復3次擴增與測序.所用引物由擎科生物技術(杭州)有限公司(Tsingke)合成.

利用NCBI 網站生物學軟件BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行cDNA及氨基酸序列同源性比對；在線軟件Translate(http://web.expasy.org/translate/)推導其氨基酸序列；在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白的分子量、理論等電點、蛋白質不穩定系數等；MEGA 6.0軟件(應用neighbor-joining法，模式為p-distance,gap空位為Complete deletion，校驗參數設置為Bootstrap=1 000)構建氨基酸序列進化樹.

表1 藍莓DNA甲基化相關基因VcMET1基因分離及表達引物

1.4 VcMET1基因在果實發育中的表達分析

根據分離得到的cDNAs序列，應用Primer 3 Input (version 0.4.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線軟件設計qPCR定量分析引物(見表1)，以VcGAPDH基因為內參[14]，使用StepOne PlusTMqPCR儀，按照SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，大連)配制反應體系，采用二步法檢測VcMET1基因在藍莓果實不同發育時期的相對表達水平.每個樣品重復3～6次，共3個生物學重復.qPCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性3 s，60 ℃退火及延伸45 s，40次循環，每個循環第2步最后5 s采集熒光信號.反應結束后進行熔解曲線分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物特異性.采用2-ΔΔCT法[19]分析qPCR數據，應用Origin 7.0軟件對數據作圖.

2 結果與分析

2.1 VcMET1基因的分離與序列生物信息學分析

利用已經公布的藍莓序列，應用PCR擴增的方法，從‘奧尼爾’S3期果實中成功分離出VcMET1基因(GenBank登錄號：KY964443.1)編碼區cDNA序列.測序序列表明該基因的開放閱讀框包含4 647 bp，編碼1 548個氨基酸殘基，分子量為174.76 kDa，等電點5.70，不穩定系數為43.08，GRAVY(總平均親水性)值為-0.516.

分析推導的氨基酸序列發現，VcMET1包含2個N端調控區的復制叉作用位點DNMT1-RFD結構域，2個參與DNA甲基化、復制與轉錄調控的BAH(Bromo adjacent homology domain)結構域及1個胞嘧啶甲基轉移酶(Dcm)結構域.進一步將分離的VcMET1序列與其他植物相關蛋白進行蛋白聚類分析發現，VcMET1與香瓜類似的MET1B蛋白(XP_008464733)有70%的相似性，并介于一年生草本與木本植物之間(見圖2)，表明VcMET1蛋白具有一定的保守性，但在進化過程中也存在物種差異性.

2.2 VcMET1基因在果實發育進程中的表達分析

應用qPCR技術，分析了VcMET1基因在藍莓果實發育進程中的相對表達水平.如圖3所示，‘奧尼爾’與‘藍雨’果實發育進程中VcMET1基因呈先上升再下降趨勢，并在果實發育早期(S0～S4期)的表達豐度顯著高于中后期的果實.‘奧尼爾’在果實發育早期VcMET1基因表達豐度相對較低，在果實快速生長階段(S3～S4期)表達快速上升，極顯著高于同時期‘藍雨’果實，并在果實后期及成熟期(S6～S7期)表達水平下降至發育初期的1/3～1/2.‘藍雨’果實發育初期(S0～S1期)VcMET1基因表達顯著高于‘奧尼爾’，分別是‘奧尼爾’的2.26倍與6.08倍，隨后表達豐度急劇下降，直至無法檢測(S4～S7期).

圖2 藍莓VcMET1與其他植物相應蛋白系統進化樹

圖3 藍莓果實發育進程中VcMET1基因相對表達分析

3 討論

DNA甲基化是重要的表觀遺傳現象，對于維持植物正常生長發育必不可少，參與基因表達的調控，如復制、轉錄、DNA修復、細胞分化等[1-4，8].植物中DNA甲基化程度主要受體內甲基化酶與去甲基化酶的調控，DNA甲基化水平過高或過低，均會導致植物生長發育異常或表型異常.在已知的3類典型DNA甲基轉移酶中，MET1主要在重復及單拷貝DNA序列中維持CG基序中胞嘧啶的甲基化，與哺乳動物Dnmt1功能類似.目前，已知擬南芥中存在4條AtMET1(MET1，MET2a，MET2b與MET3)，甜橙[20]與番茄[8]中也分別分離到一條MET1序列.本實驗僅從藍莓中分離出1條VcMET1基因序列，可能原因在于藍莓基因組及轉錄組數據庫不完善，還存在其他的VcMET1同源基因.

與其他植物相比，藍莓DNA甲基化酶基因VcMET1推導的氨基酸序列包含植物中相對保守的結構域，序列相似度也較高，表明DNA甲基化酶基因VcMET1在植物進化過程中相對保守.除催化甲基轉移至胞嘧啶的MTase結構域外，VcMET1中還存在其他蛋白識別、結合與調控的結構域BAH和DNMT1-RFD等，與前人報道中DNA甲基化酶并非單獨作用，而與其他蛋白質以蛋白復合體的形式催化特定位點的胞嘧啶甲基化的結論吻合[3-4，21].

在植物生長發育過程中，特別是果實的發育進程中DNA甲基化水平呈動態變化[3-4]，推測DNA甲基化酶在相應時期快速合成或降解，以維持其在相應階段的動態變化趨勢.Hadfield等[22]發現番茄果實在成熟過程中DNA甲基化程度下降，與DNA甲基化基因的表達降低相偶聯.進一步研究發現，隨著果實的成熟，DNA甲基化水平在果皮中降低，在腔室中變化不顯著；SlMET1在果實發育進程中呈下降趨勢，在幼果中表達豐度極高.CsMET1在甜橙‘暗柳’與‘紅暗柳’果肉中隨果實成熟表達上調，與果實后期甲基化水平上升相符[20].本研究發現，藍莓VcMET1在果實發育早中期表達豐度較高，后期表達迅速下降，甚至無法檢測.除了基因表達模式不同，不同植物中DNA甲基化的程度與分布也存在較大差異[3，23-24]，表明DNA甲基化在結構復雜的非模式植物中可能具有更為重要的作用，并且DNA的甲基化與去甲基化系統協同作用，共同決定基因組中DNA甲基化水平.

現已證明，DNA甲基化在植物生長發育調控中發揮著極其重要的作用，但大多數研究停留于擬南芥、水稻與番茄等模式植物.其他植物,尤其是對果樹果實生長發育中的相關研究報道較少，開展這方面的研究為深入解析DNA甲基化對果實發育的調控作用奠定基礎.本研究從藍莓中分離出DNA甲基化相關基因VcMET1，以及在果實發育進程中的表達模式，而有關其他DNA甲基化與去甲基化相關基因的信息，以及藍莓果實中DNA甲基化的程度與分布，如何作用于果實生長發育，仍有待于深入研究.