鄧老冠心方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內新生血管及VEGF信號通路的影響

任寶琦，李成輝，金 政

（1.廣東省中醫院心內科，廣州 510012；2.廣州中醫藥大學，廣州 510006）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）疾病的發生發展對人類的健康產生了嚴重的危害，是臨床心血管事件重要的病理學基礎。目前有大量研究證實，血管新生和動脈粥樣硬化斑塊進展密切相關[1-2]。這些新生血管可促進炎癥細胞聚集，并能誘發斑塊出血和斑塊破裂，減少斑塊內新生血管亦成為治療動脈粥樣硬化斑塊的一個備受關注的治療靶點[3]。前期臨床及實驗證實，鄧老冠心方可改善血管內皮功能及穩定動脈斑塊，從而對冠心病心絞痛有治療作用[4-6]，本研究擬進一步通過實驗觀察鄧老冠心方對AS不穩定斑塊內血管新生及導致血管新生的相關血管內皮生長因子（VEGF）信號通路的影響，從而探討其穩定AS斑塊的深入作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠10只，均為SPF級，動物來源于北京大學醫學部實驗動物中心，許可證編號： SCXK（京）2016-0133，動物合格證編號：033288。

1.2 飼料 基礎飼料：北京科澳協力飼料有限公司生產。高脂飼料：基礎飼料添加，含脂肪15%，膽固醇0.25%，北京科澳協力飼料有限公司生產。

1.3 藥物及制備 辛伐他汀片，20 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，批號 H20140046。鄧老冠心方，方藥組成：黃芪30 g，橘紅10 g，法半夏10 g，茯苓15 g，甘草5 g，枳殼15 g，竹茹15 g，五爪龍30 g，太子參

15 g，丹參15 g，田七15 g，水蛭5 g。藥材飲片由廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心藥理研究室鑒定，并用高壓滅菌蒸餾水稀釋為3 g/mL中藥湯劑。

1.4 試劑及儀器 2步法RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。Trizol，美國Invitrogen公司。引物由上海博尚生物技術有限公司合成。PCR自動擴增儀Eppendorf-5332型，德國Eppendorf公司。實時定量PCR儀Light Cycler2.0，瑞士羅氏公司。組織包埋機：德國LEICA公司，型號LEICA CM1900。冰凍切片機LEICA CM1900型，德國Leica公司。光學顯微鏡BX41型及偏振光顯微鏡BX-51型均日本Olympus公司。低溫高速臺式離心機Biofuge Stratos型，德國Heracus公司。

1.5 動物分組及給藥 8周齡雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，飼養在廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心實驗動物飼養室小鼠飼養籠內，5只/籠，飼養室恒溫（22±2）℃、人工光照明暗各12 h。C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料飲食喂養，所有飼料均經Co60滅菌處理。小鼠20周齡時隨機分為模型組、鄧老冠心方大劑量組、鄧老冠心方小劑量組、辛伐他汀組，10只/組。C57BL/6J小鼠作為正常對照組。給藥方法：鄧老冠心方高劑量組給予鄧老冠心方3 500 mg/kg灌胃，1次/d；鄧老冠心方低劑量組給予700 mg/kg（相當于臨床用量）灌胃，1次/d；辛伐他汀組給予辛伐他汀（按成人20 mg/d折算成小鼠等效劑量）灌胃，1次/d；給藥時間均為12周。模型組及正常組給予0.2 mL/只高溫滅菌蒸餾水灌胃，1次/d，時間同樣為12周。

1.6 觀察指標及方法 小鼠處死后迅速打開胸腔，左心室逆行灌注液體至主動脈，鈍性分離主動脈，主動脈根部置于4%多聚甲醛浸泡溶液中固定，CD34免疫組化半定量分析用陽性染色面積占斑塊面積的百分率表示。采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統測量并計算平均值。其余主動脈部分-80°保存。

1.7 RT-PCR檢測 mRNA 表達 采用Trizol試劑抽提小鼠胸主動脈組織總RNA，微量分光光度計檢測RNA樣品純度。然后按照反應體系進行逆轉錄以及RT-PCR反應體系及條件按試劑盒說明書進行。

以β-actin 作為內參照基因，上游：5‘-CATCCGT AAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游5‘-ATGGAGC CACCGATCCACA-3’，擴增片段長度171 bp；VEGF上游：5‘-CTTGTTCAGAGCGGAGAAAGC-3’，下游：5‘-ACATCTGCAAGTACGTTCGTT-3’，擴增片段長度125 bp。VEGFR2上游：5‘-TTTGGCAAATACAACC CTTCAGA-3’，下游：5‘GCTCCAGTATCATTTCCAA CCA--3’，擴增片段長度 177 bp。HIF-1α上游：5‘-GGGGAGGACGATGAACATCAA-3’，下游：5‘-GGGTGGTTTCTTGTACCCACA-3’，擴增片段長度115 bp。PCR 反應條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，循環40次。然后進行20 min的產物溶解程序，作溶解曲線分析，將不同濃度的定量的模板的對數和相應Ct值作圖。

結果判定：△Ct = Ct － Ctβ-actin。用各實驗組樣本的△Ct 減去正常對照組樣本的△Ct，得到△△Ct，以 2－△△Ct表示 mRNA 的相對表達量。

1.8 統計學分析 所有數據應用SPSS 12.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組數據間比較采用兩獨立樣本t檢驗，其他數據多組間均數比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用費希爾的LSD法；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鄧老冠心方對apoE-/-小鼠AS CD34陽性染色的新生血管含量的影響 見表1。

表1 鄧老冠心方對apoE-/-小鼠AS CD34陽性染色的新生血管含量的影響（，n = 10） %

表1 鄧老冠心方對apoE-/-小鼠AS CD34陽性染色的新生血管含量的影響（，n = 10） %

注：與模型組比較，## P＜0.01，△ P＜0.05 ；與小劑量組比較，▲P＜0.05

組 別 CD34陽性染色的新生血管含量模型組 7.98±2.53 DG大劑量組 3.49±0.78##▲DG小劑量組 5.46±1.12△辛伐他汀組 3.92±1.21#▲

2.2 各組小鼠胸主動脈VEGF mRNA 表達比較 見表2。

表2 各組小鼠胸主動脈VEGF mRNA 表達比較（，n = 10）

表2 各組小鼠胸主動脈VEGF mRNA 表達比較（，n = 10）

注：與正常對照組比較，### P＜0.001；與模型組比較，△△P＜0.01；與DG小劑量組比較，▲▲P＜0.01

組 別 VEGF mRNA正常對照組 1.00±0.19模型組 46.26±8.70###DG 大劑量組 19.16±2.52△△▲▲DG小劑量組 34.21±5.43△△辛伐他汀組 6.73±1.25△△

2.3 各組小鼠主動脈VEGFR-2 mRNA表達比較 見表3。

表3 各組小鼠胸主動脈VEGFR-2 mRNA表達比較（，n = 10）

表3 各組小鼠胸主動脈VEGFR-2 mRNA表達比較（，n = 10）

注：與正常對照組比較，### P＜0.001；與模型組比較，△△P＜0.01；與DG小劑量組比較，▲▲P＜0.01

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2.4 各組小鼠胸主動脈HIF-1α mRNA表達比較 見表4。

表4 各組小鼠胸主動脈HIF-1α mRNA 表達比較（，n = 10）

表4 各組小鼠胸主動脈HIF-1α mRNA 表達比較（，n = 10）

注：與正常對照組比較，### P＜0.001；與模型組比較，△△P＜0.01

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3 討論

急性心血管事件的發生與動脈斑塊的不穩定密切相關，而這種不穩定斑塊又稱作易損斑塊，隨著易損斑塊研究的不斷深入，斑塊內血管新生和易損斑塊的發生發展成為近年來研究的熱點[2-3]。在缺血、缺氧、炎癥、應激等病理因素的剌激下，內皮細胞激活，繼之從血管壁移行入間質腔，內皮細胞增生，基底膜生成，從而成為新生血管[7]。在動脈粥樣斑塊區域有來自內膜與動脈腔直接相通的毛細血管和來自外膜新生的毛細血管，它們在斑塊區域互相融合形成新的毛細血管叢，即成為斑塊的滋養血管[8]。薄壁的滋養血管很容易破裂，造成斑塊內出血，白蛋白、纖維蛋白原等血液中的成分滲漏出來，從而導致斑塊的生長、腫脹，并進一步加重血管管腔狹窄[9]。因此，斑塊內新生血管的形成與斑塊穩定性及臨床病情的變化關系密切，而斑塊內新生血管的多少成為衡量斑塊穩定性的一項新的指標[9-10]。研究[11]表明，微血管密度（MVD）是評價新生血管的最佳方法。CD34是一種特異性白細胞分化抗原，特異性表達于血管內皮細胞，故成為最敏感的的血管內皮細胞標志物之一，應用CD34抗體來進行免疫組化染色能更好的測定MVD[12]，是比較好的新生血管標記物。我們通過CD34免疫組化結果顯示，鄧老冠心方大、小劑量均可減少斑塊內血管內皮細胞標志物CD34陽性表達，即減少斑塊內血管新生，從而發揮其穩定斑塊的作用。鄧老冠心方大劑量作用更加顯著。

血管新生的發生機制非常復雜，VEGF是目前所知的最關鍵的血管生成促進因子在生理性和病理性血管新生過程中發揮著重要作用[13]。VEGF通過其受體發揮作用，受體目前發現有3種：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，新生血管內皮細胞的增殖及VEGF所誘導的粘附分子表達和血管通透性的增加主要通過VEGFR-2這一重要介質實現[14-15]。缺氧是引起斑塊內血管新生的基本原因[16-17]。缺氧環境中，HIF-1α是對VEGF起主要調控作用的轉錄因子，其可以上調下游促血管形成物質VEGF的表達[17-19]。研究[20]表明，低氧時VEGFR-2含量升高13倍。因此，HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信號通路是AS斑塊內新生血管發生的重要機制。我們的實驗結果亦表明，正常小鼠血管壁表達少量的VEGF，而AS斑塊內表達VEGF明顯，動脈粥樣硬化模型小鼠動脈壁HIF-1α表達顯著增高，和文獻報道一致[15,17]。

研究發現，鄧老冠心方大、小劑量組均可降低AS斑塊內促血管新生因子VEGF的表達，從而減少斑塊內血管新生，鄧老冠心方大劑量組更表現出和西藥辛伐他汀組同樣的優勢，并呈現出劑量依賴性（大劑量組和小劑量組比較有統計學意義）。因為VEGF與受體VEGFR-2結合發揮作用，其生物學效應通過其受體實現。因此，我們同時檢測受體的基因表達水平，發現鄧老冠心方還有效減少了VEGFR-2結合的含量，從而影響了VEGF/VEGFR-2這一產生新生血管的作用通路。通過對HIF-1α的檢測發現，鄧老冠心方大、小劑量組顯著減少HIF-1α的表達，通過有效降低HIF-1α水平，抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信號通路，進而抑制VEGF和VEGFR-2的表達，從而有效減少斑塊內血管新生的發生。

鄧老冠心方是由全國著名老中醫鄧鐵濤教授在多年治療冠心病的臨證經驗中總結出來的良方。在多年的工作中，鄧老通過對冠心病病人的診治，提出了“心脾相關”“痰瘀相關”學說，“心痛者，脈不通”，不單是血瘀為患，而痰濁閉塞，也是其主要的病理機制。該方主要功效是益氣化痰，祛瘀通絡，主治冠心病（氣虛痰瘀互阻型），因而能顯著減輕患者由氣虛而致痰阻血瘀的臨床癥狀，穩定動脈斑塊均有確切的臨床療效[4-5]，能顯著改善心絞痛癥狀，減少心絞痛發作頻率及時間，并顯著提高患者的生活質量。但機制研究較少，初步動物實驗研究發現本方能減少動脈粥樣硬化動脈斑塊面積與管腔比例及穩定纖維帽，從而起到穩定動脈斑塊的作用[5]，其深入作用途徑仍不明確。本研究從證實鄧老冠心方抑制斑塊內血管新生的基礎上，更加深入的從基因水平研究了鄧老冠心方對斑塊內血管新生的抑制作用的發生機制，發現其作用與其干預HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信號通路，降低HIF-1α、VEGF和VEGFR-2基因表達有關，為鄧老冠心方治療疾病提供理論依據。

動脈粥樣硬化發展過程中，斑塊內血管新生、氧化應激、炎癥反應相互影響并相互促進，本研究未進行其他通路的研究，更加全面、深入的研究其作用機制有待進一步探討。同時受研究時間的限制，本實驗僅進行了體內研究，未進行體外實驗，這將是我們下一步的研究方向。