參芪苡術湯通過Wnt/β-catenin通路調控胃癌細胞上皮-間質轉化的實驗研究

徐建林，陸為民

（1.南京中醫藥大學附屬鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224000；2.南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029）

胃癌的發病機制尚不完全明確，目前主要認為與遺傳因素、環境因素、飲食因素、胃部微生態等因素有關。近年來利用分子生物學手段研究胃癌的發病機制和有效藥物對胃癌的作用機制，是當前研究的熱點。有研究[1]認為中醫學可以通過健脾化痰散結法來逆轉細胞上皮間質轉化達到治療胃癌的目的。參芪苡術湯是國醫大師徐景藩教授治療胃癌的基本方，臨床療效明顯。本實驗研究圍繞Wnt/β-catenin信號通路，探討參芪苡術湯對SGC-7901細胞侵襲、上皮間質轉化（EMT）以及Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Vimentin、p-Gsk3β和β-catenin表達的影響，以進一步闡明參芪苡術湯治療胃癌的科學機制。

1 材料與方法

1.1 動物血清制備 Wister大鼠，按大鼠每天劑量為1.8 g/100 g灌胃給參芪苡術湯，連續給藥5 d，制備空白血清和含藥血清，細胞培養將空白血清稀釋10倍，含藥血清分別稀釋5、10、15倍3個濃度進行細胞實驗，則每天的對應劑量分別為3.6 g/100 g、1.8 g/100 g、0.9 g/100 g。

1.2 細胞來源 實驗細胞人胃癌細胞SGC-7901，鹽城市中醫院中心實驗室細胞庫自己保存。實驗所需儀器、試劑與耗材由鹽城市中醫院中心實驗室及江蘇醫藥職業技術學院實驗室提供。

1.3 細胞培養 SGC-7901細胞采用完全培養基（90%DMEM+10%胎牛血清）于37℃、5%CO2、20%O2的細胞培養箱中，取指數生長期的SGC-7901細胞（100 mm培養皿），用吸慮泵吸去培養液。用PBS洗滌，加入0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培養箱中消化1 min，后轉入10 mL的無菌離心管中離心，棄上清，加入凍存液，輕輕吹打使細胞重懸，然后凍存。

1.4 Transwell實驗 在4 ℃下解凍Matrigel，過夜；在冷凍細胞培養基（RPMI1640）中（不含有血清）將Matrigel稀釋至5 mg/mL；把稀釋的基質膠100 μL放入到24孔transwell的上室；37 ℃下孵育transwell 5 h，膠凝；用含1% FBS的培養基（RPMI1640）洗滌人胃癌細胞株SGC-7901細胞，連續3次；重懸人胃癌細胞株SGC-7901細胞到含有1%FBS的培養基中，密度106個/mL；用血清游離培養基洗滌凝膠基質膠；將100 μL人胃癌細胞株SGC-7901細胞懸浮液緩緩置于基質膠上；把600 μL培養基（含有5 μg/mL纖連蛋白）填充到下腔室作為粘附性底物；于37 ℃下孵育24 h；從24孔板移除transwell，并染色；刮掉transwell頂部的未浸潤細胞；在光學顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察并計數侵襲的細胞數。

1.5 Western Blot實驗 用不同濃度參芪苡術湯大鼠含藥血清（每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g）處理細胞24 h，提取各組細胞總蛋白。用參芪苡術湯大鼠含藥血清處理 LICL處理過的24 h的人胃癌細胞SGC-7901 24 h，提取細胞總蛋白。BCA檢測試劑盒測定各組細胞的蛋白濃度。分別取總蛋白15 μg上樣，經 12%分離膠及5%濃縮膠SDSPAGE 凝膠電泳后濕轉法轉 PVDF 膜。加入特異性一抗4 ℃過夜與二抗室溫孵育2 h后，暗室中曝光和顯影，測定蛋白條帶的光密度值，以表示蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學方法 使用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞形態學的影響 實驗分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細胞培養24 h后收集細胞，電鏡下觀察細胞形態。參芪苡術湯大鼠含藥血清按每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g順序排列記為參芪苡術湯大鼠含藥血清（低）、參芪苡術湯大鼠含藥血清（中）、參芪苡術湯大鼠含藥血清（高）劑量組，下同。

結果顯示，LiCl刺激24 h后，可顯著改變SGC-7901的形態，由上皮型向間質型轉化，低劑量參芪苡術湯含藥血清并不能逆轉細胞上皮間質轉化趨勢，隨著含藥血清劑量增加，在中劑量和高劑量逐漸出現上皮間質轉化被逆轉現象，從圖可以看出，中劑量和高劑量參芪苡術湯大鼠含藥血清處理后，上皮型細胞數目（所占比例）逐漸增多。見圖1。

圖1 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞形態學的影響

2.2 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞侵襲的影響 實驗分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯大鼠含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細胞培養24 h后收集細胞，采用Transwell實驗方法觀察并計數各組胃癌SGC-7901細胞侵襲細胞數目。

結果顯示，LiCl刺激24 h后，可顯著促進SGC-7901的侵襲，穿過Transwell孔的細胞顯著增多，低劑量參芪苡術湯大鼠含藥血清并不能逆轉細胞侵襲趨勢，隨著含藥血清劑量增加，在中劑量和高劑量逐漸出現侵襲被逆轉現象，中劑量和高劑量參芪苡術湯大鼠含藥血清處理后，穿過Transwell孔的細胞數目明顯減少。見圖2。穿過Transwell孔的細胞定量的統計。見圖3。

2.3 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞Wnt信號通路、EMT關鍵蛋白表達的影響 實驗分組分別為NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯含藥血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+參芪苡術湯含藥血清（高）。各組胃癌SGC-7901細胞培養24 h后收集細胞，采用Western blot方法分別檢測p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白的表達情況。

圖2 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞侵襲影響

圖3 穿過Transwell孔的細胞定量統計

結果顯示，LiCl刺激4 h后，可激活SGC-7901的Wnt信號通路促進上皮間質轉化，可使其關鍵蛋白p-Gsk3β、β-catenin和Vimentin表達上調，中劑量和高參芪苡術湯含藥血清處理后，p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達明顯受到抑制，見圖4。對p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達半定量掃描的結果。見圖5。

圖4 不同濃度參芪苡術湯（SQYZ）大鼠含藥血清對SGC-7901細胞Wnt信號通路、EMT關鍵蛋白表達的影響

圖5 p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表達半定量結果

3 討論

已知上皮-間質轉化（EMT）有助于癌癥進展和轉移[2-5]。經歷EMT的癌細胞可以獲得侵襲能力并進入周圍組織，導致轉移的發生。在EMT的過程中，上皮細胞失去與它們的相鄰組織的接觸并獲得間質性質，使得它們能夠穿透基底膜得以轉移性傳播[6]。EMT的上皮細胞標志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達下調，間葉細胞標志物波形蛋白（vimentin）表達上調。研究[7]表明腫瘤細胞具有EMT特征并且顯著增強侵襲能力，具有降低E-鈣粘蛋白水平和增高的波形蛋白，纖連蛋白，Twist和AKT2水平。轉移可能在很大程度上取決于癌細胞獲得EMT特征的能力[8-9]。研究[10]人員發現芍藥苷通過在缺氧條件下抑制EMT來阻斷乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Cui[11]推測天冬酰胺酰內肽酶可以通過AKT和MAPK信號通路通過EMT促進胃癌的侵襲和轉移。此外，EMT的作用不僅包括增加遷移，侵襲能力和轉移潛力，而且還包括獲得化學耐藥性[12]。所以，EMT抑制劑的發展可能為預防和治療癌癥提供機會。

研究[13]表明，Wnt/β-catenin信號通路在誘導胃癌EMT和侵襲轉移能力增強中發揮關鍵作用。研究[14]觀察到Wnt-1和β-catenin在晚期胃癌患者的細胞中過表達。Wnt /β-catenin信號通路在癌癥中的作用通過Wnt穩定β-catenin的能力達成，β-catenin是參與細胞與細胞黏附和信號轉導兩個獨立過程的多功能蛋白[15]。在EMT過程中，β-catenin從E-鈣粘蛋白復合物釋放到細胞質中，在細胞質中與其它蛋白質相互作用，提高β-catenin傳導增加了EMT發生的可能性[16]。此外，β-catenin可以轉移到細胞核中，驅動重要的細胞周期蛋白、癌基因和蛋白酶的表達，包括c-myc、MMP-7[17]和細胞周期蛋白D1[18]。Zhang等[19]報道，質子泵抑制劑泮托拉唑可以通過抑制過度活化的Wnt/β-catenin信號傳導通路抑制胃癌細胞的化療耐藥和EMT，不僅說明經典Wnt/β-catenin信號通路介導激活EMT和胃上皮細胞惡變，還證明了質子泵抑制劑可以抑制胃癌的侵襲。

LiCl是當前最常用的Wnt/β-catenin信號傳導通路激活劑[20]。本研究發現LiCl刺激胃癌SGC-7901細胞后可以使Wnt/β-catenin信號傳導通路關鍵蛋白p-Gsk3β、β-catenin和EMT關鍵標志物Vimentin表達上調，并在光學顯微鏡下觀測到明顯的上皮間質轉化形態學變化，以及胃癌SGC-7901細胞的侵襲能力增強，參芪苡術湯大鼠含藥血清一定濃度下可以抑制LiCl刺激胃癌SGC-7901細胞后帶來的這些變化，我們推測參芪苡術湯可能抑制胃癌發生發展過程中Wnt/β-catenin信號傳導通路的過度激活，并通過調控Wnt/β-catenin信號傳導通路抑制胃癌發生發展侵襲轉移過程中的EMT，發揮抗腫瘤效應。